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目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的增殖和分化受由一系列调节因子构成的复杂网络所调控。在这个网络中,促增殖因子,如Krüppel样因子5(Krüppel-like factor 5, KLF5)与促分化因子,如维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)在功能上相互影响、相互制约,共同参与细胞生长、增殖、分化及凋亡等过程的调节。已经证明,KLF5通过调节细胞周期调节因子的表达而促进多种细胞增殖。在心血管系统,KLF5通过促进细胞增殖而在心血管重塑过程中扮演重要的角色。RAR是一类重要的核受体,与其特异性配体结合后,通过激活或抑制一系列基因的表达而诱导细胞分化。目前已分离到三种RAR亚型:RARα,RARβ和RARγ。大量研究表明,VSMC中存在与维甲酸结合的RARα,通过该受体,维甲酸及其衍生物能促进VSMC分化,抑制其过度增殖。Nagai等人最近的研究显示,人工合成的维甲酸衍生物Am80是RARα的特异性激动剂,能通过抑制KLF5与RARα相互作用而抑制血管内皮损伤所引起的新生内膜增生。然而,目前对Am80抑制KLF5与RARα相互作用的机制尚不清楚。本实验研究Am80与RARα相互作用所激活的信号通路及其抑制KLF5与RARα相互作用的分子机制。方法:用贴块法分离、培养大鼠VSMC,胰蛋白酶消化传代,取3～5代细胞进行实验。通过免疫共沉淀研究KLF5与RARα相互作用,Western blot分析检测Am80对KLF5和RARα表达及不同信号通路抑制剂对信号通路活化、KLF5磷酸化以及KLF5与RARα相互作用的影响。结果:1 Am80诱导RARα表达,抑制KLF5表达2μM Am80刺激VSMC不同时间和不同浓度Am80刺激细胞24 h,RARα的表达水平呈时间和剂量依赖性升高;而KLF5的表达水平则呈时间和剂量依赖性降低。提示,Am80能诱导RARα表达,抑制KLF5表达。2 Am80抑制KLF5与RARα相互作用提取被Am80刺激不同时间(0、0.5、1、2 h)的VSMC总蛋白,进行交互免疫共沉淀。结果显示,在Am80刺激前后的VSMC中,KLF5和RARα均可被共沉淀,提示KLF5与RARα之间存在相互作用。Am80刺激后,免疫沉淀物中的KLF5和RARα均明显减少,说明Am80抑制二者之间的相互作用。与对照组相比,二者之间的结合在Am80刺激0.5 h和1 h明显降低,2 h基本恢复至刺激前水平。与正常组和模型组相比,给药3天组的动物模型血管组织中,KLF5与RARα的相互作用显著减少。14天后二者之间的交互作用有所增强,但仍明显低于正常组及模型组。以上结果分别从细胞水平及整体水平证实,Am80能抑制KLF5与RARα的相互作用。3 Am80通过诱导KLF5脱磷酸化抑制其与RARα的相互作用Am80作用于VSMC 0.5 h,KLF5的磷酸化水平迅速降低,2 h回升。表明Am80能诱导KLF5快速脱磷酸化。且KLF5的磷酸化水平变化与它和RARα的结合活性变化相一致。提示Am80通过诱导KLF5脱磷酸化抑制其与RARα的相互作用。Am80刺激VSMC 0.5 h,Akt的磷酸化水平明显升高,并持续至刺激后2 h。与之相反,p38磷酸化水平于Am80刺激后0.5 h明显降低,并持续至刺激后2 h。上述结果提示,在VSMC中,Am80能激活PI3K/Akt信号通路,抑制p38 MAPK信号通路,这两条通路在Am80诱导KLF5脱磷酸及抑制KLF5与RARα相互作用过程中发挥重要的作用。4 Akt抑制剂LY294002阻断Am80诱导的KLF5脱磷酸化为进一步证明Am80诱导KLF5脱磷酸化与Akt信号通路激活有关,用Akt抑制剂LY294002预处理VSMC 2 h,再用Am80刺激细胞1 h后,检测KLF5磷酸化水平。结果显示,LY294002能明显抑制Am80诱导的KLF5脱磷酸化。同时,交互免疫共沉淀结果表明,LY294002能逆转Am80对KLF5与RARα相互结合的抑制作用。上述结果进一步表明,Am80通过PI3K/Akt信号通路诱导KLF5脱磷酸化,进而抑制其与RARα的相互作用。5 Am80通过p38 MAPK信号通路抑制KLF5磷酸化为探讨p38 MAPK信号通路在KLF5磷酸化修饰中的作用,应用p38持续活化型质粒pSV-mkk6b转染VSMC,收集细胞检测KLF5磷酸化水平。结果表明,持续激活p38 MAPK信号通路能明显抑制Am80诱导的KLF5脱磷酸化。用p38抑制剂SB203580(20μM)预孵育细胞2 h后,给予Am80刺激1 h,收集细胞进行免疫共沉淀分析。结果表明,SB203580能进一步增强Am80对KLF5与RARα相互作用的抑制作用。表明,Am80通过p38 MAPK信号通路抑制KLF5磷酸化,进而抑制其与RARα的相互作用。6在Am80刺激的VSMC中,PI3K/Akt与p38 MAPK信号通路发生交谈Akt抑制剂LY294002能逆转Am80对p38磷酸化的抑制作用,而p38抑制剂SB203580对Akt的磷酸化修饰无明显影响。提示,在Am80刺激的VSMC中,PI3K/Akt与p38 MAPK信号通路之间存在信号交谈,前者位于后者上游。结论:1 Am80诱导RARα表达,抑制KLF5表达。2 Am80抑制KLF5与RARα相互作用。3 Am80通过PI3K/Akt通路诱导KLF5脱磷酸化,进而抑制KLF5与RARα相互作用。4 PI3K/Akt与p38 MAPK信号通路之间存在信号交谈,前者系后者的上游信号分子。