骨改建的过程中机械应力起着重要的作用。在骨组织细胞感受的诸多力学信号中，流体剪切力是最主要的一种形式。在骨改建过程中，成骨细胞起着重要的作用。研究表明，流体剪切力刺激后，成骨细胞的肌动蛋白细胞骨架会发生改建。 肌动蛋白细胞骨架是一种位于细胞核及胞浆内的纤维状蛋白质基质，是细胞内传递应力信号的重要途径。应力刺激可以引起肌动蛋白细胞骨架组成的张力丝的再分布，从而引起肌动蛋白细胞骨架的改建和细胞形态的改变。但是剪切力刺激成骨细胞后，肌动蛋白细胞骨架改建的微观机制目前尚不明了。 研究表明，cofilin(丝切蛋白)是存在于真核细胞胞浆内的一种可以解聚肌动蛋白纤维的蛋白。在肌动蛋白细胞骨架的动态改建过程中，cofilin起着重要的作用。体外研究表明，多种刺激可以通过cofilin的磷酸化变化，从而调控成骨细胞的肌动蛋白细胞骨架改建。另有研究表明，cofilin介导了流体剪切力刺激引起平滑肌细胞以及成纤维细胞的肌动蛋白细胞骨架改建。而对于成骨细胞，cofilin是否同样介导了剪切力刺激引起的肌动蛋白细胞骨架改建，目前尚没有文献报道。 本实验对成骨细胞施加流体剪切力作用，观察肌动蛋白细胞骨架的改建，并通过Western blot技术检测cofilin的磷酸化水平变化，进一步了解剪切力刺激引起的成骨细胞肌动蛋白细胞骨架改建的微观机制。本实验分为两部分： 实验一：不同时间剪切力作用对成骨细胞肌动蛋白细胞骨架改建的影响 目的：研究成骨细胞受到不同时间流体剪切力作用后，肌动蛋白细胞骨架的改建变化，为下一步研究肌动蛋白细胞骨架改建的微观机制提供实验基础。 方法：原代培养小鼠成骨细胞，碱性磷酸酶以及Von Kossa矿化结节染色对成骨细胞进行鉴定；选用μ-slide作为剪切力加载装置，采用12 dyne/cm<2>流体剪切力对成骨细胞作用不同时间后，用FITC-phalloidin对各实验组细胞的F-actin染色，激光共聚焦显微镜下观察各实验组肌动蛋白细胞骨架的改建变化。 结果：酶消化法与组织块法体外培养获取了原代成骨细胞，碱性磷酸酶以及VonKossa矿化结节染色阳性；剪切力作用后各实验组细胞的F-actin明显较对照组增粗，随时间延长，实验组细胞的F-actin的染色逐渐增强、纤维增粗；45 min后随剪切力作用时间的延长，肌动蛋白细胞骨架的改建趋于缓慢。 结论：采用两种酶分段消化法，获得了活力较旺盛、纯度较高的成骨细胞；12dyne/cm2剪切力作用下，15 min便可以使成骨细胞的肌动蛋白细胞骨架发生改建。45 min后随剪切力作用时间的延长，肌动蛋白细胞骨架的改建趋于缓慢。 实验二：cofilin在介导剪切力引起成骨细胞肌动蛋白细胞骨架改建中的作用研究 目的：研究cofilin在流体剪切力引起的肌动蛋白细胞骨架改建中的作用。 方法：设计制作平行平板流室加载装置，在此基础上，采用12 dyne/cm<2>的剪切力作用成骨细胞后，Western blot技术测定细胞内cofilin以及磷酸化eofilin(phospho-cofilin)的含量变化。 结果：研制得到了平行平板流室加载装置；成骨细胞受流体剪切力刺激后，随剪切力加载时间延长，phospho-cofilin含量持续升高；剪切力作用60 min内cofilin随加载时间延长有所下降，但120 min组出现了较60min组的高水平表达。 结论：所设计的平行平板加载装置设计简单，操作方便；剪切力刺激可以通过cofilin介导成骨细胞肌动蛋白细胞骨架的改建。