论文部分内容阅读
第一章大鼠晶状体上皮细胞的原代培养目的：建立一种简单快速有效的体外培养大鼠晶状体上皮细胞的方法,进一步认识其生长、分化规律。方法：取初生3-5天SD大鼠,在无菌环境下撕取其晶状体前囊膜和赤道周边部囊膜,采用胰酶消化法培养。在显微镜下观察细胞生长规律及形态学特征；免疫荧光化学法对晶状体上皮细胞进行鉴定及分析其纯度MTT法分析各代细胞的生长速率及细胞的生长曲线。结果：酶消化法培养的大鼠晶状体上皮细胞生长迅速,呈扁平不规则多边形,镶嵌状排列；第二代细胞开始细胞呈单层贴壁生长,分布均匀；从第四代细胞开始出现纤维化的趋势,细胞形态呈梭形成纤维细胞样；第六代细胞开始出现老化。从第一代细胞到第十代细胞几乎100%表达aA-crystallin,从第五代细胞开始胞浆内aA-crystallin表达量下降；第四代第五代细胞生长速率最大,第三代细胞次之；第三代细胞在培养约24h后达到对数期。结论：酶学消化法是一种高效、实用、简便的晶状体上皮细胞原代培养方法,第3代大鼠晶状体上皮细胞是进行细胞学及相关研究理想的实验对象。第二章原代培养的大鼠晶状体上皮细胞诱导去分化生成诱导多潜能干细胞的初步研究目的：将第三代大鼠晶状体上皮细胞在生长对数期导入Oct4、c-Myc、Sox2、Klf4四个具有多能性的转录因子诱导去分化为诱导多潜能干细胞。方法：用携带四个具有多能性的转录因子的仙台病毒对处于对数期生长的原代培养的晶状体上皮细胞进行诱导去分化,转染后的第七天移植至饲养层细胞上,显微镜下观察胚胎干细胞样克隆团块的形成以及其生成的效率。将生成的胚胎干细胞样克隆团块进行免疫荧光细胞化学染色鉴定胚胎干细胞标志性蛋白SSEA-1、OCT4的表达,以及qRT-PCR鉴定胚胎干细胞标志性基因NANOG、REX1、OCT4的表达。结果：诱导后的晶状体上皮细胞可生成RLEC-ES样细胞克隆团块,转染效率为0.034%±0.0092%,取RLEC-ES样细胞克隆团块进行胚胎干细胞标志性蛋白SSEA-1以及OCT4免疫荧光组织化学染色呈阳性；用qRT-PCR法检测胚胎干细胞标志性基因NANOG、 REX1、OCT4表达呈阳性。结论：大鼠晶状体上皮细胞可由携带Oct4、c-Myc、Sox2、Klf4四个具有多能性转录因子的仙台病毒诱导去分化生成RLEC-ES样细胞克隆团块,并在形态学、蛋白、RNA水平得到鉴定。