中药神康胶囊对失神经骨骼肌及运动终板作用的实验研究

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目的:探讨中药神康胶囊对大鼠失神经支配后的骨骼肌及运动终板退变的保护及延缓作用 方法:按照参考文献确定检测失神经支配的骨骼肌及运动终板(motor-end-plate,MEP)退变的方法。骨骼肌退变的检测方法为切取造模后4、8、12周末失神经支配的腓肠肌中段肌组织,经石蜡包埋后,沿肌纤维横切片(5μm),常规HE染色,用真彩色病理图像分析系统4.0(北航图像中心)测定肌细胞直径及截面积;运动终板检测方法为切取4、8、12周末神经入肌点处的腓肠肌的中上段,顺肌纤维长轴方向切取3×2cm,固定于10%含钙福尔马林溶液中24h,恒冷箱切片(15μm),应用改良Kamovsky-Root法进行乙酰胆碱脂酶(AchE)染色:入胆碱酯酶孵育液37℃孵育2h至棕红色,蒸馏水洗后常规脱水、透明、封片。染色后的切片于光学显微镜下观察。实验分组情况为:选取雄性成年Sprague-Dawley大鼠45只,按随机数字表法平均分为两组实验组,一组对照组;实验组灌服中药神康胶囊(0.4g/粒,相当于3.0g生药),组成为补阳还五汤方加减,方中包括黄芪、太子参、川芎、当归、地龙、全蝎、蜈蚣等。按灌服药量大小分为中药A组(胶囊药末溶于生理盐水,3g生药/ml,1ml/100g体重,每日一次灌胃),中药B组(1.5g生药/ml,1ml/100g体重,每日一次灌胃);对照组即生理盐水灌胃组(生理盐水1ml/100g体重,每日一次)。每组15只,于术后第2日灌胃。大鼠失神经支配后的骨骼肌及运动终板模型的制作方法为:按文献所示,选右下肢为实验侧,腹部皮肤2%碘伏液消毒后,1.5%戊巴比妥钠溶液(0.2ml/100g)腹腔内注射麻醉。无菌操作下,于臀肌间隙分离进入,暴露梨状肌及其下的坐骨神经后,于梨状肌下缘0.8cm处切除1cm坐骨神经,远近端翻转180°,分别进行固定,阻止神经间的自然生长,4、8、12周末分别于右下肢后侧纵切口取腓肠肌作实验观察。左侧同时切取腓肠肌纤维作为正常对照,分别进行3个不同组别间4、8、12周末运动终板乙酰胆碱脂酶着色强度,均匀性,及染色反映出的终板的形态的观察,对比其有无不同;同时根据肌纤维直径及横截面积的结果,以均数±标准差(x±s)进行各组间比较,采用SPSS11.0统计软件进行多个样本均数比较的方差分析,观察中药实验组与生理盐水对照组间及中药A组与中药B组间在不同时段有无差异。 结果:1肌纤维直径及横截面积的变化:在大鼠骨骼肌失神经支配后,肌纤维直径及横截面积随失神经支配时间延长呈进行性下降,但不同组别下降程度不一致。4周末肌纤维横截面切片表现为中药A组肌纤维轻度萎缩,HE染色均匀,核分布略有紊乱,纤维细胞间隙加大;中药B组肌纤维也呈轻度萎缩,HE染色均匀,核分布紊乱较明显,纤维细胞间隙同样加大;盐水组染色较浅,纤维细胞似有水肿,核分布稀疏,肌萎缩明显。三组截面积及直径经方差分析,实验A、B组肌纤维直径及横截面积与生理盐水对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。A、B组间对照差异无显著性(P>0.05);8周末肌纤维横截面切片表现为中药A、B组肌纤维进一步萎缩,染色稍淡,细胞核相对增多,间质内无增生结缔组织;盐水组萎缩较实验组明显,核分布散乱,相对增多,肌细胞形态不规则,胞浆减少程度大。三组截面积及直径经方差分析,实验A、B组肌纤维直径及横截面积与生理盐水对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。A、B两组间对照差异无显著性(P>0.05)。12周末肌纤维横截面切片表现为中药A组肌纤维萎缩严重,多数肌细胞缩小为不规则小圆形,个别肌纤维略肥大,细胞核相对增多明显,肌间隙加大,但无结缔组织及脂肪组织,染色略暗;中药B组同样表现,无规则细胞形态,肥大纤维与萎缩纤维并存,核排列紊乱,部分肌细胞仅见核存在;盐水组表现与实验组相似,核紊乱,肥大细胞与萎缩细胞并存,部分细胞仅见核存在,未见肌细胞结构形态。三组截面积及直径经方差分析,A、B组与生理盐水对照组比较差异均无显著性(P>0.05);A、B组组间对照差异也无显著性(P>0.05)。 2运动终板染色情况为:肌肉失神经支配后4周,各组运动终板酶染着色变浅,不均匀,形态不一:生理盐水对照组运动终板着色改变最为显著,AchE凝聚或扩散在一边或呈不规则状,部分出现染色空白区,终板数稀少;中药A组和B组终板染色均较生理盐水组深,AchE凝聚,形状呈不规则圆形或椭圆形,两组间无明显差异。肌肉失神经支配后8周,生理盐水组着色散在,已无明确的运动终板形态,AchE染色呈点状,数目较少;中药A组和B组终板染色均较4周时浅,形态进一步变化为不规则,但大体形态仍存在,光镜下可辨认,数目也进一步减少,但两组间仍无明显差异;肌肉失神经支配后12周,中药A组和B组及生理盐水对照组终板数均稀少,运动终板大体形态已不存在,均为散在颗粒状AchE染色,着色更浅,三组间无显著差异。 结论:本实验通过以补阳还五汤加味所形成的中药神康胶囊灌胃,进行鼠坐骨神经切断后的骨骼肌及运动终板退变的观察研究,发现:1、4-8周时,中药神康胶囊对大鼠失神经支配后的骨骼肌及运动终板产生了显著的保护和预防退变的效果,所观察和测定的图像数据与对照组差异明显,有统计学意义。2、在12周末时,所观察和测定的图像数据与对照组差异不明显,没有统计学意义。3、在4,8,12周三个时段不同用药量的两个实验组未产生显著性差异。该实验表明,在一定时限内,中药神康胶囊对外周神经赖以发挥作用的终末效应器——骨骼肌及运动终板的退变,可以产生一定的保护和延缓作用,为临床工作中应用中药防护骨骼肌及运动终板,延缓其退变提供了实验依据。
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