大豆是世界五大作物之一,也是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物,在我国种植业结构调整中发挥重要作用。南方春大豆区是我国大豆主产区之一,而在大豆种子生理成熟期正值南方高温多雨季节,种子容易发生田间劣变,从而导致种子活力降低、产量和品质下降,严重制约了我国南方春大豆的发展。开展春大豆种子田间劣变机制研究是培育抗性品种、降低春大豆种子田间劣变程度和提升我国大豆产业市场竞争力的前提和基础。同源异型盒(Homeobox,HB)基因是一类在调控植物生长发育、响应逆境胁迫和激素诱导等方面发挥重要功能的基因家族,GmSbh1(L13663)是大豆中被克隆的第一个HB基因。本实验室前期的蛋白质组学研究表明,高温高湿胁迫后,与对照相比,不抗田间劣变品种GmSBH1显著上调表达,抗性品种下调表达,表明GmSBH1可能与春大豆种子田间劣变相关。以实验室前期研究为基础,本实验开展以下研究:①春大豆种子田间劣变抗性的鉴定及其生理学机制;②大豆HB基因GmSbh1及其启动子的分离与生物信息学分析;③GmSbh1在大豆不同品种、组织器官、种子发育和萌发时期以及响应高温高湿胁迫及激素诱导的表达模式;④GmSBH1的亚细胞的定位及转录激活活性鉴定;⑤GmSbh1过表达与植株生长发育和种子劣变的关系。通过以上研究旨在为进一步从分子水平上阐明GmSbh1参与大豆种子田间劣变的机制,并为高抗种子田间劣春大豆品种选育奠定理论基础。主要研究结果如下:1.研究了种子生理成熟期(R7期)高温高湿[(40℃/30℃、RH100%/70%、10 h/14 h(昼/夜)]胁迫对宁镇1号和湘豆3号植株生长、种子活力、浸种液渗漏物含量、种子营养成分及种皮结构的影响。结果表明,短于24 h的高温高湿胁对2个春大豆品种豆荚和茎叶的生长量影响不明显,胁迫超过48 h,豆荚和茎叶生长明显受抑制,宁镇1号受抑制程度较湘豆3号明显。高温高湿胁迫和胁迫恢复后,2品种种子生活力、发芽力以及脱氢酶和酸性磷酸酶活性呈下降趋势;种子细胞膜透性增大,浸种液中的H+、可溶性糖和亮氨酸含量上升;种皮与种脐解剖结构发生改变,种子中脂肪和蛋白无规律性变化。短于5h的高温高湿胁迫对春大豆种子活力的影响不明显,胁迫超过48 h,种子活力相关指标急剧降低。高温高湿胁迫后,田间劣变抗性品种湘豆3号的发芽力、脱氢酶和酸性磷酸酶活性下降幅度显著低于宁镇1号,浸种液外渗量增加幅度低于宁镇1号,种皮的栅状细胞、柱状细胞和海绵组织的致密、厚实程度以及种脐的完整性高于宁镇1号,这可能是其抗田间劣变的生理学机制之一。春大豆种子田间劣变抗性鉴定的最佳条件是40℃/30℃、RH 100%/70%、10 h/14 h(白天/黑夜)胁迫48h。2.从大豆叶片中分离到GmSbh1的cDNA、DNA及其启动子序列,并对启动子顺式作用元件、GmSbh1的氨基酸序列及其蛋白质一级和二级结构进行了生物信息学分析。结果表明,在cDNA序列的第156～1293 bp处有一个完整的ORF,编码379个氨基酸;GmSbh1具有HB基因家族典型的KNOX1、KNOX2、ELK和Homeodomain(HD)结构域,其DNA序列包含3个内含子;有18条序列与GmSbh1核酸序列一致性大于80%。GmSbh1启动子序列包含YACT(34个)、AAAG(14个)、ARR1结合元件(11个)和AGAAA(9个)等顺式作用元件,有典型的TATAbox(-27)和CAATbox(-144bp),转录起始位点(TSS)位于ORF上游751 bp处。GmSBH1蛋白的分子量为42.37kDa,其中丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)和亮氨酸(Leu)分别为占10%、9.8%和8.4%;GmSBH1为亲水性蛋白,不具有信号肽,可能发生磷酸化的位点分别在Ser(13个)、Tys(2个)和Thr上(1个)。二级结构预测结果显示,GmSBH1序列存在α-螺旋(占39.31%)、β-转角(占5.28%)、延伸链(占8.44%)和无规卷曲(占46.97%),不存在跨膜螺旋。蛋白互作预测表明,GmSBH1与拟南芥中的RPL、BEL1、AT4G32980.1-P、BLH2和BLH3等蛋白的互作程度较高,其中与BEL1共表达的几率较高。3.采用RT-PCR技术分析了GmSbh1在大豆不同品种、组织器官、种子发育和萌发、叶片衰老以及响应高温高湿胁迫及激素诱导的表达模式。结果表明,不同大豆品种成熟种子的GmSbh1表达量差异显著,野生大豆表达量显著高于栽培大豆,抗田间劣变品种高于不抗品种。2个品种组织器官表达的特异性不同,宁镇1号中花的表达量极显著高于其它器官,种子中的表达量最低;湘豆3号嫩荚中的表达量极显著高于其它器官,幼苗中的表达量最低。大豆种子发育成熟过程中GmSbh1表达量逐渐上升,生理成熟期(R7期)表达量显著增加,完熟期(118期)表达量最高。大豆种子萌发过程中GmSbh1表达量呈先升后降趋势,吸胀24～48h表达量上升,随后下降。随着叶片的发育和衰老,GmSbh1表达呈先升后降趋势,功能叶期表达量最高。随着R7期高温高湿胁迫时间的延长,种子中的GmSbh1上调表达,48 h后上调的幅度显著增大;与对照相比,不抗田间劣变品种宁镇1号显著上调表达,抗性品种湘豆3号下调表达。100μM ABA处理大豆幼苗1 h后,宁镇1号叶片中GmSbh1的表达量极显著升高,但随着处理时间的延长表达几乎没无变化;湘豆3号叶片中GmSbh1表达量无明显变化。100μM MeJA处理大豆幼苗1h后,宁镇1号中GmSbh1显著上调表达,随后表达量逐渐下将;湘豆3号中,随着MeJA处理时间的延长表达量呈逐渐上升趋势。100μMGA3使2个品种叶片中GmSbh1的表达量均呈先升后降趋势。20μM IAA处理1 h后,宁镇1号GmSbh1极显著上升,随即下降;湘豆3号叶片的表达量一直呈下降趋势。4.采用大豆原生质体瞬时表达系统对GmSBH1进行了亚细胞定位,分别将包含GmSBH1全长、N-段(包含KNOX1和KNOX2)和C-段(包含ELK和HD)的重组质粒载体转入大豆和拟南芥叶肉细胞原生质体,激光共聚焦显微扫描结果显示,在GmSBH1-GFP和C段融合蛋白的细胞核中均能检测到明显的信号,表明GmSBH1为核蛋白,其核信号位于C段。将GmSbh1的ORF全长和部分缺失的片段连到pGBKT7载体上,重组质粒转化酵母菌株AH109进行酵母单杂交实验,验证GmSBH1的转录激活活性。结果表明,GmSBH1具有转录激活活性,其转录激活功能域位于C段的HD保守区和N段的非保守区,GmSBH1序列中的KNOX1保守域对转录激活具有抑制作用。5.比较了GmSbh过表株系和野生型拟南芥株系的幼苗形态、种子活力、高温高湿耐性、胁迫响应基因表达量的变化。结果显示,GmSbh1参与拟南芥植株的幼苗形态建成和生长发育,表现为转基因株系的子叶狭长、叶柄变宽、真叶皱稍、根毛增多,生育期延长,簇状花序、长角果变弯曲等。转基因株系黄熟期的种子经高温高湿胁迫后(40℃,RH 100%,8 h)生活力显著高于野生型,膜脂过氧化程度显著降低。低浓度ABA下(0.5-1.0μM),转基因株系成苗率显著低于野生型,幼苗生长受明显抑制;高浓度ABA下(30-50μM),转基因株系根系生长受抑制现象更明显;100μM ABA处理后,与野生型相比,转基因株系中的ABA诱导基因AtRD29A,AtRD29B和AtABI3显著或极显著上调表达,说明GmSBH1的转录调节功能可能受ABA信号诱导。高温高湿胁迫后,转基因株系中响应高温逆境胁迫的基因HsfA2和HsfB2A显著上调表达,进一步说明GmSbh1基因可能参与转基因响应高温高湿胁迫和种子劣变。