本论文选取云南特有的、濒危且狭域分布的两种植物云南黄连和金沙江石斛为研究对象,根据研究对象的自身生物学特性及受迫因素,主要采用文献研究、植物组织培养、分子生物学、繁殖生态学等方法和技术进行了研究,主要结果如下:　　 1.云南黄连学名探讨　　 我们发现现代研究对云南黄连的拉丁学名存在较大的争议,为了解决这一问题,采用文献调查的方法进行了研究。结果表明,云南黄连的记载始于《滇南本草》,人工栽培约有130年历史,在我国西南区药用植物中占有非常重要的位置。Coptis teeta Wall.一直被作为云南黄连的学名,并被当代权威植物学家所认同。但是,云南黄连(C.teetoides C.Y.Cheng et Hsiao)与西藏黄连(Coptis teetaWall.)在形态特征、组织结构、DNA信息、TLC薄层色谱、HPLC指纹图谱等方面存在较大差异。因此,应恢复云南黄连C.teetoides C.Y.Cheng et Hsiao的合法地位,该种是一个区别于Coptis teeta Wall.的独立物种。这个研究结果明确了云南黄连的系统分类学地位,为此植物的深入研究奠定了基础。　　 2.云南黄连繁殖生态学研究　　 根据前人的对云南黄连(Coptis teetoides)的研究基础,从繁殖生态学的角度对其进行了研究,并对云南黄连的显著繁殖特性予以特别关注:高有性繁殖投入(种子量大)、低有性繁殖产出(出苗率低)及发达的克隆繁殖。所得主要结果如下:　　 云南黄连具有多样性的花部特征:花瓣常为绿色,亦有红褐色及中间过渡色;雄蕊有三种类型:雄蕊正常型、雄蕊退化型及花丝反卷型;单花内各个心皮的聚集式样也不同,多数花开放后心皮向四周分散,而部分花朵向心聚集。多数花瓣发育后开始泌蜜,在花瓣整个持续期内花蜜均存在。云南黄连花药成熟存在爆发现象,花朵从总苞内抽出后17-19d为散粉高峰期,近50%的花药在这3d内成熟散粉,此后每天成熟花药的数量为0-2个,表明云南黄连兼具同时和逐步呈现花粉呈现特性。花寿命可持续39.37±0.37d;控制授粉实验及花粉萌发荧光显微镜观察表明,云南黄连整个花期内柱头均具可受性,盛花期花粉粒的离体萌发率为0.38±0.02,且花丝枯萎后45d的少数花粉粒仍具有萌发能力,表明云南黄连的花粉粒具有较长的寿命。云南黄连的有效传粉昆虫为东方蜜蜂(Apis ceranaFabricius),对盛花期花朵单花平均拜访时间最长,为3.65±0.30s,对末花期花朵的平均拜访时间为2.31±0.41s,虽然拜访时间较短,但二者不存在显著差异,表明花粉可能是云南黄连为传粉者提供的主要酬物。花粉萌发荧光显微镜观察也表明,盛花期柱头的花粉粒数目最多,显著高于始花期和末花期的花朵,与东方蜜蜂偏好访问盛花期相一致,证实了东方蜜蜂为有效云南黄连的有效传粉者。云南黄连单花花粉粒数目为74733.33±7193.58,胚珠数目78.19±5.15,P/O比为930.03±94.2。依据Cruden的标准,繁育系统属于兼性异交。云南黄连杂交指数(OCI)值为4,根据Dafni的标准,云南黄连的繁育系统属于异交,部分自交亲和。人工控制实验结果表明,云南黄连自交和异交均可发生结实,为兼性繁育系统。因此可断定云南黄连具有兼性繁育系统,自交和异交均可发生。套袋实验证实云南黄连具有延迟自交现象,其柱头在花期内均具有可受性,而雄蕊在开花16d后开始成熟散粉,在此后的时间内云南黄连的雌性和雄性功能发生重叠,雄蕊在成熟过程中花丝不断伸长靠向具可受性的柱头,从而完成自动自交。　　 云南黄连每个花序的平均花朵数目为2.14±0.07,单花的心皮数为11.71±0.78,单心皮的胚珠数为6.68±0.31,单心皮种子数为3.39±0.10,种胚比为0.51,平均结实率为94.0%,因此云南黄连具有较大的种子生产。云南黄连种子千粒重为0.72±0.03g、含水量为11.89±0.23%,其含油量较高,达44.2%,云南黄连46.5%种子具有胚,在种子成熟脱落时,胚为发育完全仅处于原胚阶段,云南黄连萌发时间持续较长,长达9个月,存在明显的后熟现象,200mg L-1 GA3处理,可有效打破云南黄连休眠,使41.07±1.85%种子开口,35d左右即可伸出胚根。因此可判断云南黄连的休眠类型为形态生理休眠(MPD)。野外调查表明,贡山的2个居群的种子没有萌发,仅福贡居群发现实生苗,平均萌发率为3.25%。云南黄连种子在腐殖土、细沙及红土等培养基上不能萌发。用酒精灭菌1min和HgCl2消毒10min的种子在在添加10g L-1琼脂的无菌培养基上萌发率为5.37±1.15%,90.0±2.5%的种子因感染真菌而死亡。经严格的表面消毒后,最后一次清洗种子的无菌水没有长出真菌,表明从云南黄连内分离得到的真菌为内生菌。根据形态特征,将其鉴定为Alternaria alternata(Fr.)Keissl。分离菌株的ITS的碱基序列在GeneBank中用Blast查询,将此菌株鉴定为Alternaria alternata(Max ident100%,E value0.0,Query coverage100%)。综合分子生物学与形态结果,表明该菌株为Alternaria alternata(Fr.)Keissl。结合该菌株导致了云南黄连种子萌发失败及克隆繁殖进化的可能因素,我们推断其直接导致了云南黄连现存的繁殖模式:较高的有性生殖投入与较低萌发率并存,并且它是促使云南黄连发生克隆繁殖进化的主要因素,克隆生长是对云南黄连有性繁殖丧失的一种适应性进化。此研究深入调查了云南黄连的繁殖生态学特性,解释了其现有的繁育模式形成的机制,尤其是内生真菌导致了云南黄连种子死亡,这为提高其种子萌发率提供了重要线索,对云南黄连的保育具有积极意义。　　 3.金沙江石斛离体快繁及开花诱导　　 离体种质资源保存是濒危物种保护一条重要途径,对兰科植物保护更具意义。因此开展了金沙江石斛(Dendrobium wangliangii)种子非共生萌发研究,表明授粉后240d的果实具有较高的萌发率,达92%。光照可促进其种子萌发。1/2MS适于原球茎增殖,在添加2 mg L-1 BA和0.1 mg L-1 NAA的培养基上原球茎的出芽率为28.79%。100 ml L-1 CM可提高不定芽增殖系数但其具有较高的致死率(49.92%)。首次在石斛属中发现双胚现象,并且成功实现了其离体开花。1 mgL-1 GA3中预处理15d后,转入添加2 mg L-1 BA,0.1 mg L-1NAA和100 ml L-1CM的1/2MS培养基中,原球茎的萌发率达到54.68%,每个原球茎平均出芽7.32个。2 mg L-1 BA,0.1 mg L-1 NAA和100 ml L-1 CM的组合对不定芽增殖也有较好的效果。100 ml L-1 CM在原球茎和不定芽增殖中对白化均具有较好的控制效果。2 mg L-1 TDZ可使金沙江石斛花芽诱导率达到100%,但在0.3 mg L-1 PP333和0.5 mg L-1 NAA的组合下花朵发育较为正常。本研究成功实现了金沙江石斛的离体快繁,为该植物的离体种植保存奠定了坚实基础。　　 4.金沙江石斛保护遗传学研究　　 为了了解金沙江石斛的居群遗传结构和遗传多样性水平,利用磁珠富集法设计了金沙江石斛的SSR引物,并合成了其中的40对,为金沙江石斛的种群遗传学分析及繁育系统的定量测量奠定了基础。金沙江石斛的系统位置确定可为其保护提供基础信息,因此,通过金沙江石斛核基因片段ITS序列及与NCBI所登录的54种国产石斛属植物的ITS序列所构建的NJ系统发育树,确定了金沙江石斛在石斛属中的系统地位,其隶属于石斛组,亲缘关系与齿瓣石斛最近。　　 5.濒危原因及保护策略　　 对云南黄连的繁殖生态学研究表明,种传内生真菌Alternaria alternata是导致种子萌发率低的首要因素,通过该线索,可以抑制Alternaria alternata在云南黄连种子萌发中的致死作用,提高云南黄连种子萌发率,并将实生苗引入原生居群,增加由于长期的克隆生长而导致的较低的遗传多样性水平,从而提高云南黄连对环境变化的适应能力。　　 本部分研究了金沙江石斛和云南黄连的濒危机制。金沙江石斛的濒危现状主要与以下几个因素有关:分布极为狭窄且个体数量少,观察发现该植物为高度自交植物,气候异常变化对金沙江石斛也产生了一定的影响,如持续的干旱不仅降低了种群数量而且也显著影响了种群的有性更新,最重要的是,其生境受到人类活动的严重干扰,放牧、人为采集、砍伐及筑路对金沙江石斛造成灭绝性的灾难。针对以上致濒因素,应保护和恢复金沙江赖以生存的自然环境和生态系统,通过设立自然保护区等行政手段禁止在其分布区内进行破坏性的人为活动,此外利用当地居民的神山信仰等加强金沙江石斛的就地保护;还可在其花期进行异花授粉,减少长期自交对金沙江石斛造成的负面影响。亦可通过离体种质保存的方法对金沙江石斛进行迁地保护。