论文部分内容阅读
干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,IRFs)是一类在干扰素(Interferon,IFN)信号通路中起重要调控作用的多功能转录因子。在哺乳动物中,IRF1、IRF3和IRF7是激活调控IFN的主要IRF亚型,其中,IRF3被证实是最主要的调控因子。然而,鸡天然缺失IRF3,这使得鸡IFN调控机制更为复杂。本课题组前期研究发现,鸡虽然缺失IRF3,但鸡IRF7能部分替代IRF3参与干扰素刺激因子(Stimulator of Interferon Genes,STING)介导的IFN调控过程。作为在哺乳动物中另一重要的IFN调节因子,在IRF3缺失的鸡细胞中,鸡IRF1(chIRF1)是否具备IFN调控作用?chIRF1在IFN调控过程中与IRF7是否存在相互促进或制约关系?是本研究拟解决的两个科学问题。为确定chIRF1在IRF3缺失的鸡细胞DF-1中的功能,本研究首先克隆了chIRF1基因,序列分析发现该基因DNA结合域在进化中较保守。通过双报告及q PCR检测发现过表达chIRF1能显著激活IFN-β启动子、上调IFN-β和IFN激活基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的mRNA水平。通过缺失chIRF1不同功能域,发现其转录抑制区、DNA结合区、核酸定位区及转录激活区在激活IFN-β中缺一不可。缺失IFN-β启动子上不同预测结合位点,发现chIRF1主要与IFN-β启动子的第三个干扰素调节因子结合位点结合。以上结果表明chIRF1参与鸡IFN-β表达调控。通过q PCR检测发现chIRF1在健康鸡的脾脏等免疫器官中的表达量较高,且AIV或NDV感染的鸡的各组织中chIRF1及IFN-β的mRNA均上调,暗示chIRF1参与抗病毒天然免疫反应。体外细胞实验发现,chIRF1过表达能有效抑制AIV及NDV在DF-1细胞中的增殖。为了进一步确认chIRF1参与抗病毒免疫反应,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了chIRF1缺失的DF-1细胞系,病毒增殖实验发现,NDV和AIV在chIRF1缺失的DF-1细胞中增殖能力明显增强。以上结果表明chIRF1作为重要的IFN-β调控分子参与了抗病毒免疫应答。基因共表达发现,野生型DF-1细胞中chIRF1并不能有效增强STING介导的IFN-β激活作用。然而,在IRF7缺失细胞系中,chIRF1可显著增强STING激活IFN-β的能力,同时chIRF1对IFN-β的激活也较野生型DF-1中提高10倍以上。在IRF7缺失细胞系中共表达chIRF1和不同剂量的IRF7,Western Blot显示随着IRF7蛋白表达量的增加,chIRF1蛋白量逐渐减少。推测IRF7可能通过抑制chIRF1的表达或以某种方式降解了chIRF1蛋白,从而影响了chIRF1参与STING介导的IFN-β激活调控过程。综上,本研究表明chIRF1可参与IFN-β激活调控,并在抗病毒天然免疫中发挥重要作用,同时chIRF1可与IRF7相互协调参与STING介导的IFN-β的激活调控,这为进一步完善STING依赖的IFN-β信号通路的内涵奠定了研究基础。