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以扣囊复膜胞酵母菌总DNA、工业酿酒酵母总DNA和毕赤酵母表达载体pMETαB为模板，通过PCR扩增克隆到约1500bp、2950bp和300bp的α-淀粉酶基因(AMY)、α-乙酰乳酸合成酶基因(ILV2)和α因子分泌序列(MFalS)，将其分别插入YEp352和pBlueseriptMl3~-质粒获得克隆载体pLA6、pLV2和pBLα。克隆载体的酶切分析表明二克隆基因与GenBank的报道序列基本相同，克隆到的α-淀粉酶基因与GenBank中报道序列的酶切位点有差异，克隆基因内有SacⅠ酶切位点，大约距起始密码子100bp，GenBank中报道的基因序列无SacⅠ酶切位点；而报道的α-淀粉酶基因序列在距起始密码子72bp处有BglⅠ酶切位点，克隆α-淀粉酶基因无BglⅠ酶切位点。克隆的乙酰乳酸合成酶基因内有一个XbaⅠ酶切位点，而报道的序列有两个酶切位点，其它酶切位点均相同。 以酵母菌穿梭载体YEp352为出发质粒，酵母磷酸甘油酸激酶基因1(PGKl)启动子和乙醇脱氢酶基因1(ADHl)终止子为调控元件构建了含α-淀粉酶编码序列的酵母菌重组表达质粒pLA8。用醋酸锂转化法将pLA8导入单倍体酿酒酵母菌株，转化子可以在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长，并使受体菌的ura缺陷型得到互补。说明克隆到的淀粉酶基因可以表达有活性的淀粉酶。将pLA8导入工业酿酒酵母菌株Sc-11，在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子，转化子培养液中α-淀粉酶活性为1.1U／ml，细胞破碎液的酶活性为0.3U／ml，淀粉水解率为38％。说明扣囊复膜胞酵母菌(S．fibuligera)α-淀粉酶四川大学博士论文基因分泌序列不能在工业酿酒酵母菌sc·11中有效引导a一淀粉酶分泌至胞外，使部分a一淀粉酶滞留在胞内。转化子的遗传稳定性为71%。 鉴于pLAS的酵母转化子淀粉酶表达量低，并有部分滞留在胞内，为了有效引导淀粉酶分泌至胞外，促进转化子的淀粉酶分泌，在AMY编码序列起始密码子前插入酵母a一因子分泌序列构建酵母菌重组表达质粒pLA8a。用醋酸铿转化法将pLA8a导入工业酿酒酵母菌，在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子sc一11一pLA8a，转化子培养液中a一淀粉酶活性为6.3U/ml，说明a一分泌序列可以有效引导a一淀粉酶分泌至胞外并促进菌体细胞生长。转化子在最佳条件下降解83%的淀粉，可以用于淀粉发酵。进一步对转化子进行麦芽汁糖发酵试验，检测了其发酵麦汁中残糖含量、乙醇含量和风味物质的含量。结果表明残糖含量降低18%，AM了基因的引入对酵母的发酵特性未产生很大影响，可以认为转化子的发酵特性与受体菌一致，转化子遗传稳定性为80%。 因为自主表达质粒在受体细胞体中表达存在不稳定现象，在工业化的长期应用中可能丢失，使工程菌利用淀粉性状丢失。本研究采用构建整合表达工程菌来克服遗传新性状表达不稳定性问题。考虑到酵母菌是食品级微生物，在啤酒发酵中产生a一乙酞乳酸，并渗透至胞外非酶转化为双己酞，影响啤酒风味，使啤酒有几周的后熟期。本研究以a一乙酞乳酸合成酶基因为同源整合序列构建了整合质粒pMGI3。pMGI3经月尸口I十Notl酶切获得约5.6kb含tlvZ::A几tY嵌合基因片段，用于酵母转化并在YNBS培养基上筛选阳性转化子sc·1卜MGI3。经PCR验证淀粉酶基因整合在受体染色体的IL人基因上，sDs一PAGE证明在约55kDa处有一条明显的蛋白条带。转化子培养液中a一淀粉酶活性为4.3U/ml，转化子不仅可以利用淀粉为唯一淀粉而生长并使a-乙酞乳酸酶活性降低30%;淀粉发酵实验表明其可降解65%的淀粉:麦芽汁发酵实验证明发酵液双乙酞含量和残糖含量分别降低70%和13%;转化子在非选择培养条件下的遗传稳定性为100%，而其它发酵特性与受体菌相比无很大差异。转化子不含细菌抗生素抗性基因和酵母抗药性选择标记。 本研究证明通过PCR扩增获得的翅材y编码基因在酵母磷酸甘油酸激酶基因l(尸GK了)启动子和乙醇脱氢酶基因1(A DHI)终止子为调控元件下表达具生物活性的a一淀粉酶。所构建的酵母穿梭表达质粒pLA8a转化子可以有效分泌表达淀粉酶，表达量高，可用于以淀粉为原料的工业发酵制品生产;但其在工业四川大学博士论文应用中存在丢失现象，遗传稳定性较差。所构建的整合表达片断转化子Sc一11一MGI3可以有效分泌表达淀粉酶，表达量较高，其遗传稳定性高，适于在工业发酵生产应用，尤其适于工业啤酒生产。关键词:淀粉酶基因，克隆和表达，乙酞乳酸合成酶基因，工业酿酒酵母， 遗产稳定性，双乙酞