本课题利用慢性束缚方法,模拟肝郁日久,木郁乘土,肝郁脾虚的病理演变过程,成功复制出大鼠肝郁脾虚证模型。逍遥散是治疗肝郁脾虚证的名方,本实验试图探讨逍遥散的一条重要调节通路。边缘系统是肝主疏泄的调控中枢,是动机和情绪产生的发源地,它一方面接受内外环境的刺激,及时做出反应;另一方面接受体内状态的反馈信息,调整其状态,产生适应性反应。海马和杏仁核是边缘系统的主要组成部分,二者的平衡协调可能是情绪得以正常表达,生理功能得以正常执行的关键。慢性束缚应激导致杏仁核尤其BLA区兴奋,海马抑制。有报道称双侧杏仁核微量注射AMPA受体拮抗剂CNQX对大鼠有保护作用。AMPA受体是非常重要且唯一的调节杏仁核和海马输入信号的突触后处理场所。尽管NMDA受体在各种急性状态下对神经损伤起重要作用,但研究表明AMPA受体在神经元退行性变过程中起更重要的作用。AMPA受体调整兴奋性神经传递,在突触发生、形成神经通路和突触可塑性方面(包括LTP和LTD)起着重要的作用。AMPA受体由GluR1-4组成,GluR1是大鼠表达LTP的关键亚基,慢性束缚应激导致海马CA1区GluR1阳性细胞数上升,直接或间接对大鼠活动下降负责,是对大鼠适应能力影响的主要因素;GluR2是AMPA受体控制Ca2+渗透的关键亚基,下调GluR2 mRNA表达,导致Ca2+异常通透,导致海马神经元的退行性变。当前认同AMPA受体拮抗剂CNQX比NMDA受体拮抗剂MK-801更能有效阻止CA3区锥体神经元受损。本实验拟拮抗双侧杏仁核AMPA受体,抑制杏仁核尤其抑制BLA区兴奋,通过行为学观察以及免疫组化和RT-PCR技术检测各组大鼠海马CA1区、CA3区、DG区和杏仁核BLA区AMPA受体各亚基的变化,同逍遥散组进行比对,以亟发现逍遥散在调节肝郁脾虚证的一条可能重要通路。本课题为国家自然科学基金(No.30672578)资助课题。本实验由四部分组成。第一部分,肝郁脾虚证大鼠模型的建立与评价。第二、三和四部分探讨逍遥散调节肝郁脾虚证的一条重要通路,是论文的重点,分别从行为学、免疫组化和RT-PCR三方面分析。第一部分:肝郁脾虚证大鼠模型的建立与评价。实验目的:通过动物行为学、宏观表征和反映小肠吸收功能的尿D-木糖排泄率确证慢性束缚应激方法造成大鼠肝郁脾虚证模型。内容:60只大鼠随机分为3组:对照组、模型组和逍遥散组。每天3h束缚造模,共21天。通过三方面对此模型评价:①对大鼠宏观表征、食量、体重、粪便变化及反映小肠吸收功能的尿D-木糖排泄率检测;②对大鼠旷场实验进行分析;③以方测证:逍遥散的调节作用。结果:模型组大鼠由初次束缚时反抗不安,逐步转变为神态倦怠、烦躁、毛发枯黄散乱无光泽、大便稀溏等;模型组大鼠体重增长缓慢,尿D-木糖排泄率逐渐降低;第7天开始穿格数、站立次数、修饰次数均有下降趋势,第21天达到最低点。而逍遥散对模型组大鼠有显著的调节作用。结论:利用慢性束缚方法造模,模拟肝郁日久,木郁乘土,肝郁脾虚的病理演变过程,成功复制出大鼠肝郁脾虚证模型。第二、三和四部分试图探讨逍遥散调节肝郁脾虚证的一条重要通路。分别从行为学、免疫组化和RT-PCR三方面分析,是实验重点。大鼠共分五组,正常组、模型组、假手术组、CNQX组和逍遥散组。每天3h,束缚21天后,第22天开始手术。假手术组和逍遥散组分别在双侧杏仁核微量注射生理盐水0.5μl, CNQX组双侧杏仁核微量注射CNQX溶液0.5μl(0.5μg)。除逍遥散组灌服逍遥散溶液外,其它组灌相同体积的生理盐水。模型组只束缚不手术。第25天进行行为学观察,第26天分别灌注固定取材留做免疫组化和剥离取海马和杏仁核组织留做RT-PCR。第二、三和四部分总实验目的:慢性束缚应激导致杏仁核兴奋,海马抑制。CNQX通过拮抗杏仁核AMPA受体,抑制其兴奋性,对海马神经元起保护作用。逍遥散的调节通路是否与CNQX作用通路相似?第二部分:肝郁脾虚证大鼠双侧杏仁核注射CNQX后行为的变化及逍遥散的调节作用。内容:对大鼠宏观表征、体重及旷场实验进行分析。结果:模型组大鼠呈现肝郁脾虚证表现;假手术组大鼠呈现焦躁状态;CNQX组起到治疗作用,大鼠焦躁状态得到抑制;逍遥散组大鼠表现与正常组相近,逍遥散起到很好的调节作用。结论:①拮抗双侧杏仁核AMPA受体,抑制杏仁核尤其BLA区兴奋性,可以缓解焦躁状态,起到治疗作用;②逍遥散起到很好的调节作用。第三部分:免疫组化检测各组大鼠海马CA1区、CA3区、DG区和杏仁核BLA区的AMPA受体亚基GluR1、GluR2/3和c-fos变化,比对逍遥散组和CNQX组的指标变化趋势,推测逍遥散的调节通路。结果:①c-fos阳性细胞数在CA1区、CA3区、DG区和BLA区变化趋势基本相似,与应激强度正相关。②GluR1阳性细胞数:在CA1区和DG区变化趋势基本相似,与正常组比较,模型组和假手术组均有统计学意义(均P<0.01),且均较正常组增高;在CA3区,与正常组比较,模型组和假手术组均有统计学意义(均P<0.01),且均较正常组GluR1阳性细胞数减少;在CA1区、CA3区和DG区,正常组、CNQX组和逍遥散组间均无统计学意义(均P>0.05)。在BLA区,CNQX组由于拮抗AMPA受体,阳性细胞数最低。其它各组变化趋势与CA1区各组间变化趋势相反,且正常组和逍遥散组间无统计学意义(均P>0.05)。GluR1阳性面积、MOD和IOD的变化趋势与阳性细胞数变化趋势大致相似。③GluR2/3阳性细胞数在海马各区变化趋势基本相似,且GluR2/3阳性细胞数变化趋势与GluR1阳性细胞数变化趋势相反。在海马CA1区、CA3区和DG区,与正常组比较,模型组和假手术组均有统计学意义,且均较正常组减少;正常组、CNQX组和逍遥散组间无统计学意义(均P>0.05);在BLA区,CNQX组由于拮抗AMPA受体,阳性细胞数最低。其它各组变化趋势与CA1区各组间变化趋势相反,且正常组和逍遥散组无统计学意义(均P>0.05)。GluR2/3阳性面积、MOD和IOD趋势与阳性细胞数变化趋势大致相似。结论:①慢性束缚应激导致AMPA受体亚基GluR1和GluR2/3阳性细胞数变化趋势相反,且这二个指标分别在海马和杏仁核的变化趋势相反;②分别以假手术组或模型组为参照,逍遥散组和CNQX组免疫组化提示:这二组GluR1和GluR2/3指标分别在海马和杏仁核变化趋势均相似,推断逍遥散可能通过抑制杏仁核尤其抑制BLA区兴奋,即通过抑制杏仁核BLA区AMPA受体的兴奋,起到缓解海马各区受损的调节作用。拮抗杏仁核AMPA受体,纠正杏仁核和海马的“兴奋-抑制”失衡,重建稳态,可能是逍遥散治疗肝郁脾虚证的一条重要作用通路。第四部分,RT-PCR结果变化趋势和实验三变化趋势基本吻合,在海马和杏仁核,逍遥散组和CNQX组GluR1 mRNA、GluR2 mRNA和GluR3 mRNA的基因表达变化趋势基本一致,验证实验三的结论。综上,本实验提示:慢性束缚应激方法造成大鼠肝郁脾虚证模型;肝郁脾虚证大鼠杏仁核尤其BLA区兴奋,海马抑制;拮抗杏仁核BLA区AMPA受体,抑制杏仁核,尤其抑制BLA区兴奋,可以缓解海马各区受损。通过拮抗杏仁核AMPA受体,纠正杏仁核和海马的“兴奋-抑制”失衡,重建稳态,可能是逍遥散治疗肝郁脾虚证的一条重要调节通路。