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益生乳酸菌在肠道中的定植能够排斥外来病原菌的入侵,从而起到生物抗菌的作用。粘附过程是乳酸菌定植的第一步,由于菌体表面的各种粘附相关成分是介导粘附的基础,从而对这些成分的研究分析是阐明益生菌粘附机理的必要条件,而粘附机理的深入研究对于消化道微生态环境的改善以及病原菌的生态防治均具有重要意义。本文以从健康牙鲆肠道中分离筛选的乳杆菌新种L15 为实验材料,对其参与粘附过程的表面蛋白质成分进行了初步的分离、分析鉴定和纯化。首先进行细菌生长曲线的测定,在37℃液体MRS 培养基厌氧培养条件下,L15生长的潜伏期为6h,此后进入对数生长期,至18h 到达稳定期。通过比较5mol/L酸性氯化锂、5mol/L 中性氯化锂、8mol/L 尿素三种不同的试剂,选定了提取蛋白种类和数量相对较多的5mol/L 中性氯化锂进行表面蛋白质的提取。在不同培养时间、培养温度和培养基盐度实验条件下,5mol/L 中性氯化锂提取得到的L15 表面蛋白质的种类和数量都有较大的差异,通过比较,选定了在MRS 培养基中37℃静置培养16h 的培养条件。5mol/L 中性氯化锂处理前后的菌体扫描电子显微镜结果显示,虽然L15 由原来的二连体状态变为分散的单体状态,但是细菌细胞结构完整,而且在上述培养和提取条件下,表面蛋白提取前后L15 对牙鲆肠粘液的粘附能力有较大变化,表明提取的蛋白质为表面蛋白质,而且在表面蛋白质中存在参与肠粘液粘附的成分。采用蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定L15 中参与粘附的表面蛋白质成分,即牙鲆肠粘液经酯化生物素(B-NHS)处理后,与转移到硝酸纤维素膜上的L15 表面蛋白质共同孵育,再经过与辣根过氧化物酶标记的亲和素(HRP-Avidin)的作用,DAB 显色显示出菌体表面参与粘附的蛋白质只有一种,分子量为61.8kDa,将之命名为MAPPpo1。同样,利用B-NHS 标记L15 全蛋白后,与转移到硝酸纤维素膜上的牙鲆肠粘液蛋白共同孵育,再经HRP-Avidin 和DAB 的作用,结果显示牙鲆肠粘液中存在两种分子量接近的蛋白质-29.7kDa 和30.3kDa-参与了粘附过程。上述结果证明,L15 表面存在蛋白质MAPPpo1 参与了与牙鲆肠粘液的粘附过程,该表面蛋白质能够与粘液中两种分子量接近的蛋白质成分发生特异性相互作用。运用亲和柱层析法进行L15 表面粘附蛋白MAPPpo1 的纯化。首先将牙鲆肠粘液与溴化氰活化的Sepharose-4B 偶联,L15 菌体全蛋白上Sepharose-4B 柱后4 ℃孵育过夜,PBS 洗涤掉非特异性粘附的菌体蛋白后,利用含0.1mol/L 氯化钠和