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胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的糖调节激素。主要生理活性是在机体高血糖时,刺激β胰腺细胞分泌胰岛素,而在血糖正常时而不分泌胰岛素而避免引发低血糖。GLP-1是很好地治疗II型糖尿病的潜在生物蛋白。但由于GLP-1在体内代谢的特殊性,对于维持生物蛋白的稳定性和保持生物蛋白的活性成为研究的热点。课题组前期研究结果显示,GLP-1二联体与人血清白蛋白(HSA)N端连接的GGH融合蛋白在毕赤酵母中表达,生物蛋白半衰期从20 min提高至57.8 h。与HSA融合后的GLP-1类似物(GGH)的稳定性得到了明显的提高,但活性不高。本论文以课题组前期研究为基础,首先,构建GLP-1突变体体外检测的细胞模型,并设计GLP-1的突变体。其次,在毕赤酵母(P.Pastoris)表达系统中,对信号肽剪切酶位点的设计、与HSA融合时优化GLP-1串联体的数目及在N端添加His-tag的方式,从三方面对GLP-1类似物(GGH)进行设计,以提高GLP-1类似物的比活性。然后,将在毕赤酵母表达系统中高活性的生物蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达,增加GLP-1类似物成药性的可能。最后,对CHO细胞表达的GLP-1类似物(GGH)参照药典的一般要求进行质量检测,并探索GLP-1类似物(GGH)的定向分化活性。实验结果如下。(1)为GLP-1类似物筛选提供一种简单可靠的评价方法,构建一种体外检测的细胞模型。经单克隆筛选和遗传霉素压力筛选最终筛选获得一株高表达的细胞模型(CHO/pcDNA3.1/hGLP-1R)。RT-PCR、流式细胞仪检测结果和激光共聚焦结果显示该细胞模型株构建成功。活性检测结果显示该细胞模型可以很好地用于GLP-1类似物活性的检测,且较野生的细胞模型株(RINm5f)的响应值高、培养方便。为设计获得新颖的GLP-1类似物,化学合成5种GLP-1类似物。突变的GLP-1类似物经体外细胞活性检测显示,与阳性对照组相比最大半数有效浓度提高23倍以上。因此,突变的GLP-1类似物的成药性不强。(2)实验室前期构建的菌株(P.Pastoris/pPIC9K/GGH)是甲醇氧化酶(AOX1)启动子表达的菌株,保留了Kex2和Ste13两种信号肽剪切酶位点,表达的蛋白简写为AOX/GGH。在P.Pastoris表达系统中对生物蛋白进行改造和设计,结果如下。1.为消除甲醇对酵母的毒副作用,将GGH利用甘油醛三磷酸脱氢酶(GAP)启动子在P.Pastoris表达。结果显示,利用GAP启动子和AOX1启动子的表达GGH的产量和活性相当,但GAP启动子的发酵时间缩短了20 h,且GAP启动子的发酵培养过程更加简单方便。2.为消除剪切位点不专一的Ste13信号肽剪切酶位点,将Ste13位点去除而只保留Kex2位点。去除Ste13酶切位点后,GLP-1类似物(GGH)的比活性较提高到1.45倍,但表达量却下降了31%。3.为研究GLP-1与HSA融合蛋白时GLP-1最佳串联体数目,以及为获得N端均一的蛋白。将GLP-1与HSA的融合蛋白的N端添加His-tag,并在其后添加肠激酶(enterokinase,EK)的蛋白酶酶切位点。设计GLP-1的单体,二联体,三联体分别与HSA的N端融合连接(GH、GGH、GGGH),同时考察融合蛋白前面添加一个保护氨基酸(A,ala)对活性的影响。实验结果显示,GLP-1二联体与HSA的融合的方式能减少HSA对GLP-1空间构型的影响,而能最好地保留GLP-1类似物活性。同时,通过His-tag再经肠激酶酶切获得的9K/GGH较AOX/GGH的N端更加均一、纯化回收率为提高50%,且生物蛋白的比活性提高到4.66倍。(3)为提高突变的GLP-1类似物(GGH)的活性和减少生物蛋白的免疫原性,将P.Pastoris筛选最优的融合蛋白在哺乳动物细胞CHO中表达,同时设置对照实验。经过四个循环的细胞株筛选,获得三株重组细胞株CHO/pMH3/GGH、CHO/pMH3/AGGH和CHO/pMH3/NGGH,细胞稳定性结果显示筛选获得的细胞株为稳定表达的单克隆细胞株。WB验证验证后在3 L的流加瓶放大培养。CHO/GGH、CHO/AGGH、CHO/NGGH的最高表达量分别为437 mg/L、358 mg/L和322 mg/L,较摇瓶的批次产量提高6倍左右。CHO/NGGH的生物活性最高,且较P.Pastoris表达的融合蛋白(9K/GGH)的比活性提高到1.36倍。(4)对制备的CHO/NGGH进行质量检测。参照《2015版中国药典》第三部生物制品原料药的一般要求和检测方法,对中国仓鼠卵巢细胞表达获得的生物蛋白GGH进行原料药的检测。检测结果显示符合药典对原料药的一般要求,可为GGH原料药的质量标准制定提供参考。进一步对GGH药理进行部分的研究。CHO/NGGH生物蛋白浓度大于100 nM时,能有效地刺激RINm5f细胞的增殖,培养三天后细胞密度增加约0.5倍。摸索调整并确定了一种较为有效的诱导方法,CHO/NGGH生物蛋白浓度为500 ng/mL(6.9 nM)下,第5天就可以观察到间充质干细胞(MSC)的聚集生长,细胞团经DTZ染色后呈现枣红色,初步表明该细胞团是胰岛样细胞。诱导后胰岛样细胞的标志基因(Insulin、PDX-1、NGN3和NKX6.1)较诱导前有明显转录提高,进一步表明该细胞团是胰岛样细胞。诱导形成胰岛样细胞的胰岛素分泌实验结果显示,胰岛样细胞具有一定的胰岛细胞的功能。