论文部分内容阅读
背景与目的急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)常伴随着肠道屏障损伤与肠道菌群紊乱。潘氏细胞通过分泌抗菌肽维持肠道屏障功能正常且参与维持肠道菌群稳态。本研究观察潘氏细胞抗菌肽对ANP大鼠肠道损伤的影响并对其机制进行初步的探讨。方法逆行胆胰管注射3.5%牛黄胆酸钠溶液建立大鼠急性坏死性胰腺炎模型,尾静脉注射100 mg/kg双硫腙溶液建立大鼠潘氏细胞耗竭模型,在尾静脉注射双硫腙溶液6h后诱发大鼠急性坏死性胰腺炎以建立ANP+双硫腙大鼠联合组模型,所有大鼠在各自造模后6h、12h、24h、36h及48h处死并留取标本。依各组大鼠自然死亡率绘制Kaplan-Meier生存曲线;Schmidt评分标准评估各组大鼠胰腺病理损伤;肠道损伤用以下指标评估:Chiu’s评分标准评估各组大鼠末端回肠病理损伤;测定血清二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸的水平评估肠道通透性,ELISA检测血清与肠道组织TNFα、IL-1β和IL-17A水平,评估全身及肠道炎症;荧光原位杂交技术(FISH)检测肠道菌群移位情况。荧光定量PCR及免疫荧光观测末端回肠潘氏细胞溶菌酶的表达及潘氏细胞计数。气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测各组大鼠粪便短链脂肪酸的含量;荧光定量PCR检测各组大鼠粪便 Ruminococcaceae_UCG-005 及 Ruminococcaceae_UCG-014 的表达。蛋白印迹(western blot)检测末端回肠粘膜内质网应激蛋白BIP及ATF6的表达。结果Kaplan-Meier生存曲线显示假手术组、双硫腙组、ANP组及ANP+双硫腙联合组造模后48h的生存率分别为100%、98.8%,78.7%及50.5%。ANP组各个时间点胰腺病理损伤及评分高于假手术组,联合组各个时间点胰腺病理损伤及评分高于相应时间点的ANP组,尤其在24h及36h(p<0.05)。与假手术组比较,ANP组各个时间点末端回肠病理损伤及评分逐渐加重,肠道通透性指标升高;末端回肠及血清炎症因子TNFα、IL-1β和IL-17A表达水平增加并伴随有肠道菌群移位。联合组与ANP组比较,在各个时间点联合组末端回肠病理损伤及评分明显高于ANP组织(P<0.01),尤其是6h;ANP组及联合组血清DAO及D-乳酸含量随时间逐渐升高,在6h、12h、24h联合组较ANP组肠通透性损伤更明显(p<0.05);联合组末端回肠炎症因子普遍高于ANP组,其中IL-17A及IL-1β水平在 6h,12h,24h 较 ANP 组明显上调(分别为 6h、12hp<0.01,24hp<0.05),而TNF-α水平在各个时间点皆较ANP组升高(分别为6hp<0.01,12h、24h、36h、48hp<0.05)。ANP组及联合组血清炎症因子表达随时间逐渐上升,联合组血清TNFα,IL-1β及IL-17A水平在6h、12h、24h较ANP组明显升高(分别为TNFα,IL-1β 6h p<0.01,12h、24h<0.05;IL-17A6h、12h、24h P<0.05);FISH 显示联合组肠道菌群移位最明显。qPCR显示ANP组溶菌酶基因表达量较假手术组下降且溶菌酶基因表达下降与肠通透性指标及炎症因子表达上调呈负相关,免疫荧光显示联合组溶菌酶的表达最低且潘氏细胞计数最少。大鼠粪便短链脂肪酸ANP组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量随时间的延长进行性下降,联合组短链脂肪酸含量普遍低于ANP组,其中乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸的含量随时间的延长轻度升高,丁酸、异戊酸的含量随时间的延长变化不明显,联合组乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的含量在6h,12h较ANP组明显下降(p<0.05),异丁酸、异戊酸的含量在6h较ANP组比较明显减少(p<0.05);大鼠粪便Ruminococcaceae_UCG-005 及 Ruminococcaceae_UCG-014 的基因表达在 ANP 组随时间的进展逐渐下降,在联合组表达下降的最明显,其中6h、24h联合组明显低于ANP组(p<0.01)。ANP组及联合组末端回肠粘膜BIP及ATF6蛋白随时间延长表达上调,且在检测的6h、24h、48h联合组的表达强于ANP组(p<0.05)。结论潘氏细胞耗竭后急性坏死性胰腺炎大鼠生存率降低,胰腺及末端回肠组织的病理损伤加重,肠通透性增加,末端回肠及血清炎症因子TNFα、IL-1β和IL-17A的表达上调,肠道菌群移位明显并伴随着抗菌肽的减少。潘氏细胞作为保护因子可能通过其分泌的抗菌肽减少,致与其相关的厚壁菌门Ruminococcaceae_UCG-005 及 Ruminococcaceae_UCG-014 数量减少,并导致相应的细菌代谢产物乙酸生成减少,乙酸减少可能增强了肠道上皮内质网应激进而导致急性坏死性胰腺炎大鼠肠道的损伤。