蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸残基的N-端肽键,广泛应用于蛋白的肽图谱及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN主要来源于脑膜脓毒性黄杆菌和假单胞杆菌两种细菌的分泌,产量较低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。原核表达重组内肽酶AspN成为了解决问题的关键。　　原核表达蛋白酶主要会有两个难题,一是包涵体表达,则复性比较困难;二是可溶性表达活性酶,则会发生自切及对宿主菌的毒性。本研究通过重组融合表达的方式进行两种内肽酶AspN,flavastacin和peptidyl-Asp metalloendopeptidase的表达。其中, flavastacin/pET32采用Trx融合表达的方式来可溶性表达,通过Ni金属螯合层析柱进行一步亲和层析获得高表达的融合蛋白,然后将融合蛋白进行激活,使融合标签自行切除,从而制备出高活性及高纯度的目的蛋白;peptidyl-Asp metalloendopeptidase/pGEX采用GST融合的方式进行蛋白的可溶性表达,通过GST亲和层析柱进行初步纯化,并经过后续的离子交换层析、疏水层析获得了高纯度的活性酶。随后通过HPLC、SDS-PAGE、荧光实验进行两种酶活检测,验证酶活及纯度。结果显示两种酶均具有良好的纯度和活性,并能很好地应用于蛋白的酶切及质谱检测。　　本课题首次利用基因工程技术在大肠杆菌里重组可溶性融合表达内肽酶AspN,该重组酶具有高表达的同时,还可以通过亲和层析和离子交换层析等层析方法对该酶进行快速地纯化,从而得到高纯度的目的蛋白。运用荧光实验对酶进行定量分析,此两种酶除了具有和提取酶相似的活性及蛋白酶切特性外,具有制备简单,表达量纯度高的特点。为该酶广泛应用于质谱及晶体结构研究及和活性作用机制研究奠定了良好的基础。