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背景特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成人肾病综合征最常见的病理类型之一,也是目前原发性肾小球疾病的第二大病理类型。约有30%-40%的患者可在5-15年内进展至终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD),患者的生活质量受到严重影响。近年来中国IMN临床发病率呈逐年上升趋势,以每年13%的速度增长,因此重视IMN的防治有着重要的社会及经济意义。研究证实,IMN是由抗足细胞抗体介导的自身免疫性肾脏病,足细胞在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激下可引发足细胞发生上皮-间充质细胞的转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),导致足细胞相关蛋白表达异常,肾小球滤过屏障受损,进而出现蛋白尿,严重时可导致足细胞从肾小球基底膜上脱离或凋亡,加重蛋白尿及肾小球硬化。目前西医治疗主要以免疫抑制剂为主,但由于IMN的发病机制尚未完全明确,经过治疗后部分患者不能缓解,并逐渐进展为终末期肾脏病。近年来,越来越多的中医学者致力于IMN的中医药研究。综合国内大量研究结果,中医药其独特的优势在治疗IMN方面具有不俗的疗效,可改善患者临床症状、延缓肾功能进展。王暴魁教授认为,IMN病性属本虚标实,核心病机为“正气亏虚、风邪入肾”,研制扶正祛风方,以此指导临床治疗,经前期研究证实疗效显著,可显著减少IMN患者蛋白尿,降低阳离子化牛血清白蛋白(cationized-bovine serum albumin,C-BSA)肾炎模型大鼠的蛋白尿水平,改善肾脏病理,调控部分足细胞相关蛋白的表达,其保护足细胞的具体机制尚待进一步探究。基于足细胞转分化与IMN蛋白尿密切相关性,本课题欲探讨扶正祛风方对IMN足细胞转分化的调控机制及作用靶点,从而深入阐明扶正祛风方治疗IMN的取效机制,进而为推广临床有效方剂、优化IMN治疗方案供科学依据,并且为中药治疗IMN提供可靠的新思路。目的通过动物实验,构建C-BSA肾炎模型,观察扶正祛风方对C-BSA大鼠蛋白尿、肾功能指标(BUN、Scr)、肾脏病理、足细胞转分化信号通路蛋白(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)及足细胞转分化表型标志物Desmin的表达水平,探讨扶正祛风方对C-BSA大鼠足细胞转分化的调控作用。方法1.选取生长时间6周左右的SPF级健康雄性SD大鼠90只,适应性喂养1周,期间自由饮水与摄食,其后测定24小时尿蛋白含量(24 hU-pro)均小于5mg后将大鼠随机分配,分为空白组15只、造模组75只。2.建立C-BSA大鼠模型,造模组参考Border法,采用尾静脉注射C-BSA,其后测定24 hU-pro>20mg提示造模成功。3.造模结束后将造模组大鼠随机等分为模型组、高、中、低剂量中药组及西药组。高、中、低剂量中药组给予相应剂量的扶正祛风方灌胃治疗,西药组给予氯沙坦钾片灌胃治疗,正常组、模型组均给予等量去离子水,连续4周。4.观察各组大鼠的一般情况,在灌胃2、4周后分别检测其24 hU-pro;灌胃结束后腹主动脉取血检测肾功能指标(BUN、Scr),并留取各组肾组织,分别在电镜与光镜下观察肾组织病理变化;采取Western blot法检测各组足细胞转分化信号通路蛋白TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及足细胞转分化表型标志物Desmin的表达情况,比较各组间差异。5.全部数据采用SPSS22.0统计软件进行数据处理,计量资料以x±s表示各组数据,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.一般情况空白组大鼠精神状态佳,反应较灵敏,毛发有光泽,大小便无明显异常。造模大鼠在造模期间,逐渐出现精神不振,反应灵敏度降低,毛发泛黄、无光泽,甚至脱落,摄食量减少,尿量增加,大便逐渐转为稀溏,部分颈后预免疫部位出现脱毛至皮肤裸露或尾静脉注射部位坏死,给予局部消毒处理,另有部分大鼠可见腹水、阴囊水肿。药物组进行干预治疗后就上述模型组大鼠相比,其精神状态、反应灵敏度、毛发脱落、大小便等一般情况相对较好,灌胃结束后逐渐有所好转。药物组之间无明显观察性差异。2.24小时尿蛋白定量大鼠在造模后检测24hU-pro,结果显示造模后模型组和药物组大鼠蛋白尿较空白组、造模前均显著升高(P<0.01);灌胃2周及灌胃4周后,药物组大鼠蛋白尿水平仍高于空白组(P<0.01),但较模型组均有所下降(P<0.05),且灌胃2周及灌胃4周时,中剂量中药组分别与高剂量组、低剂量中药组相比较,其蛋白尿下降均有统计学意义(P<0.05),与西药组相比较降低蛋白尿有统计学意义(P<0.05)。3.肾功能指标模型组BUN、Scr较空白组均有所升高(P<0.05);相比于模型组,药物组降低BUN有统计学差异(P<0.05),且中剂量中药组与高剂量组中药组、低剂量中药组比较无统计学差异(P>0.05),高剂量组中药组、中剂量中药组、低剂量中药组与西药组相比降低BUN有显著统计学差异(P<0.01);药物组的Scr与模型组相比,仅中剂量中药组降低Scr有统计学差异(P<0.05)。4.肾组织病理形态学观察与空白组相比,模型组大鼠电镜下可见足突广泛融合,基底膜增厚,上皮下大量电子致密物沉积,光镜下可见肾小球体积增大,基底膜增厚及空泡变性,肾小管上皮细胞水肿,伴有上皮下嗜红复蛋白沉积;灌胃治疗后,各剂量中药组及西药组与模型组相比下均有一定程度减轻,电镜下可见上皮下免疫复合物沉积减少,基底膜增厚及足细胞足突融合的程度有所缓解,光镜下可见基底膜增厚及肾小管上皮空泡变性减轻,嗜红复蛋白沉积减少,总体上中剂量中药组病理程度减轻更为显著。5.足细胞转分化信号通路蛋白(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)及足细胞转分化表型标志物Desmin的表达情况检测各组相关蛋白表达水平,结果显示,与空白组比较,模型组大鼠肾小球的TGF-β1蛋白的表达有显著升高(P<0.01),Desmin蛋白的表达与磷酸化Smad2、磷酸化Smad3的比值有明显升高(P<0.05),Smad7蛋白的表达有明显降低(P<0.05)。给药4周后,与模型组相比,药物组大鼠肾小球的TGF-β1蛋白的表达显示中剂量中药组降低有统计学差异(P<0.05);药物组大鼠肾小球的Desmin蛋白的表达显示高、中剂量中药组和西药组降低均有统计学差异(P<0.05),且与中剂量中药组相比,高剂量中药组和西药组的降低无统计学差异(P>0.05);药物组大鼠肾小球的Smad7蛋白的表达显示中剂量中药组升高有统计学差异(P<0.05);药物组大鼠肾小球的Smad2、p-Smad2蛋白的表达显示中剂量中药组的磷酸化Smad2有明显下降(P<0.05);药物组大鼠肾小球的Smad3、p-Smad3蛋白的表达显示高剂量中药组的磷酸化Smad3有明显下降(P<0.05)。结论扶正祛风方可以改善大鼠一般情况,能够减少C-BSA模型大鼠蛋白尿,降低血BUN、Scr,并改善肾脏病理损伤;同时扶正祛风方可以减少足细胞转分化中信号通路TGF-β1蛋白的表达,降低磷酸化Smad2、磷酸化Smad3的比值,升高Smad7蛋白的表达,下调高表达于C-BSA模型大鼠足细胞转分化表型标志物Desmin蛋白,改善足细胞转分化,总体疗效以中剂量的扶正祛风方更为显著。由此也可以得出,扶正祛风方对足细胞转分化信号通路蛋白(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)及足细胞转分化表型标志物Desmin蛋白的调控可能是实现对膜性肾病大鼠足细胞的保护作用机制之一。