颗粒蛋白前体Progranulin（PGRN）是一个具有多结构域和多重生物学功能的分泌型糖蛋白分子,广泛表达于多种不同类型的细胞中。研究表明,PGRN除参与组织发育、损伤修复、内质网应激、炎症反应和免疫调控等生理过程,还参与一些疾病发生发展的过程,如神经退行性疾病、代谢相关疾病和肿瘤等。PGRN通过与不同的分子相互作用发挥着特定的功能。因此,通过探索PGRN相互作用分子对其生物学功能研究具有重要意义。本实验在前期研究中,通过酵母双杂交筛选出一系列与PGRN相互作用的候选分子,其中候选分子谷氧还蛋白3（Glutaredoxin3,GLRX3）引起了我们的关注。GLRX3是谷氧还蛋白家族成员,广泛表达于不同组织和细胞中。GLRX3作为巯基转移酶具有许多重要的生物学功能,如参与体内氧化平衡、电子传递、铁硫蛋白形成、细胞增殖、胚胎发育及肿瘤迁移等。最近有文献报道,GLRX3可能会通过影响EGFRmRNA水平的表达,参与EGFR/Akt信号通路调控的细胞增殖和迁移。同样,PGRN也参与肿瘤的发生及发展过程,并可以通过刺激EGFR的下游靶分子P13K激活EGFR信号通路,促进肿瘤发生及发展。目前关于PGRN与GLRX3两者相互作用的区域及其所介导的生物学功能并不清楚,但基于目前这些研究报道,我们提出这样的一个科学问题,是否PGRN与GLRX3相互作用会通过EGFR信号通路参与调控肿瘤细胞增殖和迁移?为了探索上述科学问题,本研究通过以下四个部分内容进行探讨。1.针对人GLRX3单克隆抗体的制备:使用原核表达的蛋白6His-GLRX3作为免疫原制备针对人GLRX3单克隆抗体,并通过WB、细胞染色和IP检测抗体的特异性;然后分别采用携带GST标签的GLRX3三个结构域蛋白,通过免疫印迹对抗体所能识别的GLRX3结构域进行鉴定;最后依据GLRX3蛋白在进化中的保守性,用这些抗体通过WB检测Hepal-6、L6、CHO、Zf4的GLRX3蛋白。2.PGRN与GLRX3相互作用区域的鉴定:为了确定PGRN与GLRX3各自相互作用区域,分别构建含有AD结构域的GLRX3全长及其三个结构域的酵母表达载体;然后将这些载体与前期实验室已构建好的含有BD结构的PGRN全长及不同截短体的酵母表达载体进行酵母双杂交实验。并在此基础上,通过GST-pull down、激光共聚焦和Co-IP实验进一步验证两者的相互作用。3.GLRX3影响PGRN蛋白水平的机制研究:将GLRX3转染HEK293细胞,然后通过real-time PCR检测GLRX3过表达对内源性PGRN mRNA表达的影响;将PGRN与GLRX3共转染HEK293细胞,然后通过WB检测GLRX3对PGRN蛋白水平的影响;在此基础上,根据已报道的GLRX3催化活性位点构建携带GLRX3活化位点突变的真核表达载体,并将这些GLRX3突变体与PGRN分别共转染HEK293细胞中,通过WB和Co-IP明确GLRX3催化活性位点是否对PGRN蛋白水平产生影响;最后将GLRX3与PGRN的不同截短体分别共转染HEK293细胞中,通过WB明确PGRN分子中那些结构域可以介导GLRX3对PGRN蛋白水平的影响。4.PGRN与GLRX3相互作用参与EGFR信号途径调控的MDA-MB-231细胞增殖和迁移的影响:首先利用GLRX3-KO HEK293细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统研究GLRX3和PGRN对EGFR promoter活性的作用;然后,利用GLRX3或PGRN单基因敲除的MDA-MB-231和GLRX3&PGRN双基因敲除的MDA-MB-231细胞系,通过MTT、划痕、Transwell及透射电镜TEM等实验手段检测GLRX3和PGRN对MDA-MB-231细胞增殖和迁移以及细胞器的影响;最后通过在这些基因敲除的MDA-MB-231细胞系瞬时表达GLRX3、GLRX3突变体或/和PGRN,利用real-time PCR检测GLRX3与PGRN分别对EGFR信号途径、内质网应激（ERS）和细胞迁移过程中相关分子mRNA表达的影响。通过上述研究,本课题取得了以下研究结果。1.成功获得了 5株特异性识别hGLRX3蛋白的单克隆抗体（命名为No.1-5）,其中 No.1 识别 Grx1 domain、No.2-4 识别 Grx2 domain、No.5 识别 Trx domain;细胞染色和IP检测结果显示,除了 No.1之外,其余4株抗体均能识别天然构象的GLRX3蛋白;除了 No.5,其余四株不仅能识别人源GLRX3蛋白,还能识别来源其它物种GLRX3蛋白。2.通过酵母双杂交实验确定了 PGRN与GLRX3相互作用的区域（Gm B与Grx1结合、Gm C与Grx2结合）;并通过激光共聚焦实验确定了 PGRN及其截短体与GLRX3共定位于细胞质区域,其中GrnBAC与GLRX3共定位最为明显;通过GST-pull down实验明确了 PGRN与GLRX3存在直接的相互作用。通过Co-IP实验发现,本研究未能检测到PGRN的表达,因此本研究推测GLRX3可能对PGRN蛋白稳定性有影响。3.基于上述的推测,本研究对GLRX3介导PGRN蛋白水平影响的机制进行了研究,发现GLRX3可以影响PGRN蛋白的稳定性,而且这种影响依赖于GLRX3中具有催化活性位点的Cys残基（C159和C261）及PGRN中的Grn B和Grn C结构域。4.通过双荧光素酶检测系统研究发现,GLRX3与PGRN参与调节EGFRpromoter的活性。通过MTT实验结果表明,GLRTY3-KO、PGRN-KO和GLRX3&PGRP-KO的MDA-MB-231细胞的增殖明显降低;通过划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明,GLRX3-KO MDA-MB-231细胞的迁移能力降低,而PGRN-KOMDA-MB-231迁移能力显着加快;通过TEM观察发现,基因敲除的MDA-MB-231细胞发生线粒体肿胀、内质网扩张,并且GLRX3与PGRN双基因敲除的细胞伴有凋亡发生;最后通过real-time PCR检测结果发现,MMP1、IL1β、EGFR及C-myc的mRNA表达水平在GLRX3敲除的细胞中明显下降,在PGRN敲除的细胞中则明显升高,这个结果与划痕、侵袭和TEM实验一致。本研究首次鉴定了 PGRN与GLRX3相互作用的区域,并发现GLRX3通过其159位和261位的半胱氨酸残基影响PGRN蛋白的稳定性;另外还发现GLRX3与PGRN相互作用参与EGFR信号途径调控的细胞增殖和迁移。本研究为进一步阐明在三阴性乳腺癌细胞中PGRN与GLRX3相互作用对于调控肿瘤增殖和迁移的分子作用机制奠定了理论基础。