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人体免疫系统能够对肿瘤细胞进行识别并清除,但是肿瘤细胞在发生发展过程中,可以利用负调控通路募集免疫抑制性细胞,抑制效应T细胞的功能,逃避免疫系统的攻击,发生肿瘤的免疫逃逸。免疫检查点是免疫反应中的传递共刺激或抑制信号的分子,其中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(Cytotoxic T-lymphocyteassociated protein 4,CTLA-4)是近年来免疫检查点的热门研究对象之一。CTLA-4是存在于T细胞表面的、起传递抑制性信号作用的跨膜蛋白,能抑制T细胞免疫应答的启动,避免机体正常免疫过程中效应T细胞的过度活化。由于效应T细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用,所以近年来靶向CTLA-4的抗肿瘤免疫治疗药物也成为了研究的热点。目前针对CTLA-4的抑制剂主要有Tremelimumab与Ipilimumab两种单克隆抗体,能有效阻断CTLA-4与配体的结合,二者在临床上均有良好的疗效,但是以抗体为基础的治疗方法,在应用于慢性疾病(如癌症)的治疗时,会带来巨大的成本、制造和监管方面的挑战。为弥补抗体存在的不足,研究人员最近报道了两种能阻断CTLA-4的功能的核酸适体,但是亲和力和稳定性方面存在不足。为克服上述单克隆抗体和天然核酸适体存在的问题,本论文提出了,利用功能性非天然核酸分子,从基因和蛋白水平上抑制CTLA-4的表达和信号传导作用,实现对免疫系统的激活。本论文的主要工作分为以下两方面:第一,以CTLA-4蛋白为靶点进行体外筛选,获得了非天然核酸适体,能阻断CTLA-4与B7受体的结合;第二,设计合成了含化学修饰的脱氧核酶分子,选择性结合并催化CTLA-4m RNA的切割反应,降低CTLA-4蛋白的表达量。在第一部分工作中,为获得靶向结合CTLA-4的非天然核酸适体,我们首先优化了基于毛细管电泳技术筛选非天然核酸适体的方法。结合毛细管电泳技术分辨率高、筛选效率高和非天然核酸适体生物稳定性好的优势,我们进一步利用酶催化反应产生非天然核酸文库的方法,实现了非天然核酸适体的毛细管电泳筛选,为核酸适体的研发提供了优异的筛选手段。本文对以2’-甲氧基修饰核苷酸为底物的引物延伸反应、逆转录反应、样品回收、PCR反应等试验条件进行了优化,并对建立的筛选方法进行了验证。以鼠源CTLA-4蛋白作为靶标分子进行筛选,经过三轮的富集,获得富集的文库,对其测序获得候选适体的序列信息。用MFold软件对候选适体进行二级结构预测分析,可知G含量普遍较高,并且大多为茎环结构。利用Dot Blot(点斑迹法)测试候选适体与CTLA-4的亲和能力,通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)来测试候选适体在体外阻断CTLA-4与B7蛋白结合的效果,最终获得性能较为优异的非天然核酸适体C22T5。这项工作证明了建立的非天然核酸适体的毛细管电泳的筛选方法是可靠的、高效的,为非天然核酸筛选提供了一种有效的平台,也使非天然核酸适体作为CTLA-4的阻断剂成为可能。为在基因水平上降低CTLA-4蛋白的表达,我们选用了脱氧核酶10-23来靶向催化CTLA-4的m RNA的切割反应,从而降低CTLA-4蛋白的表达。通过在脱氧核酶特定位点添加2’-甲氧基修饰,可提高10-23的生物稳定性。延长10-23催化CTLA-4 m RNA切割反应的时间,可提高核酸酶的切割效果。进一步地,我们利用多条含上述化学修饰的10-23脱氧核酶序列,分别对鼠源和人源CTLA-4m RNA在模拟生理条件下进行多位点共切割,发现可以提高对CTLA-4 m RNA的切割效率。总之,通过化学修饰核酸酶和多位点共切割的策略,我们实现了在模拟体内环境下对CTLA-4 m RNA的高效切割,为未来将该基因沉默体系应用于体内奠定了基础。综上所述,我们利用非天然核酸适体和脱氧核酶分子,分别从蛋白和基因水平上实现了对CTLA-4信号传导功能的抑制,为激活免疫应答提供新的工具和方法。同时我们建立的非天然核酸适体的毛细管电泳的筛选方法,为非天然核酸适体的筛选提供了新的选择。