子痫前期(preeclampsia,PE)为妊娠期特有的疾病,以血压升高为主要临床表现。PE为胎盘源性疾病,发病机制不明,其中滋养细胞功能障碍导致的子宫螺旋动脉重铸障碍为重要发病机制之一。而滋养细胞的生物学行为调控涉及各种因素,本文就长链非编码RNA(Lnc RNA)通过调控滋养细胞生物学行为进而参与子宫螺旋动脉重铸过程进行研究,关注长链非编码RNA TUG1(Taurine Up-regulated Gene 1)调控滋养细胞的生物学行为模式以及其发挥作用的分子机制。本论文分两个部分,循序渐进的探索了TUG1和子痫前期发生的相关性。第一部分为明确TUG1参与子痫前期,并且能够导致滋养细胞生物学行为的异常,最终引起子宫螺旋动脉重铸不足。本研究首先在子痫前期胎盘组织中检测TUG1的表达量,结果显示TUG1在子痫前期胎盘组织相对于正常妊娠显著降低,而后通过在体外滋养细胞系中构建TUG1高表达、低表达的细胞模型探索其对滋养细胞生物学行为的调控,最终得出结论认为TUG1能够影响滋养细胞增殖、迁移、侵袭以及血管形成的能力。在明确了其生物学效应外,我们展开了第二部分的研究,即探索TUG1在滋养细胞中发挥作用的分子机制。我们采取了核质分离,RNA免疫共沉淀技术,染色质免疫共沉淀技术以及结合二代高通量测序、生物信息学分析手段,得出结论:TUG1能够绑定EZH2抑制RND3的表达,在正常生理过程中维持滋养细胞的增殖活性,但是随着子痫前期的发生,TUG1表达下调,导致上述机制被打破,RND3抑制解除,细胞受损,导致了螺旋动脉重铸障碍。以上结果证实了长链非编码RNA TUG1参与了子痫前期的发生发展,并且是通过调控滋养细胞产生效用的。研究结果提示长链非编码RNA TUG1有望成为子痫前期治疗的新型靶点,为子痫前期早孕期的预测以及干预提供新的思路。目的:1、明确长链非编码Lnc RNA TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织相对于正常妊娠孕妇的表达差异2、明确长链非编码RNA TUG1对滋养细胞生物学行为增殖的影响3、明确长链非编码RNA TUG1对滋养细胞生物学行为迁移及侵袭的影响4、明确长链非编码RNA TUG1对滋养细胞生物学行为血管形成能力的影响方法:1、收集52对子痫前期以及正常妊娠组孕妇的胎盘组织,行PCR检测其中TUG1的表达量,分析临床数据后统计2、滋养细胞HTR-8/SVneo、JEG3以及人脐静脉内皮细胞HUVEC中进行转染小干扰RNA低表达模型,验证转染效率3、滋养细胞HTR-8/SVneo、JEG3中敲低TUG1后MTT、克隆形成实验以及Ed U增殖实验明确TUG1对滋养细胞增殖的调控4、滋养细胞HTR-8/SVneo、JEG3中敲低TUG1后transwell实验明确TUG1对滋养细胞侵袭、迁移的调控5、在HUVECs中敲低TUG1后观察网状结构形成数目6、滋养细胞HTR-8/SVneo、JEG3中敲低TUG1后明确TUG1对滋养细胞生命进程的调控结果:1、52对胎盘组织结果显示子痫前期胎盘组织相对于正常妊娠组TUG1显示差异低表达。分析临床数据,两组孕妇吸烟、体重、年龄等无统计学差异,蛋白尿、血压、胎儿出生时体重具有统计学差异2、成功在滋养细胞以及脐静脉内皮细胞中改变TUG1的表达量,转染效率可。3、MTT、克隆形成实验以及Ed U增殖实验结果显示TUG1低表达情况下滋养细胞增殖活性减弱4、transwell实验结果显示TUG1低表达情况下滋养细胞侵袭、迁移能力减弱5、脐静脉内皮细胞管型形成实验结果显示TUG1低表达情况下,血管形成能力减低6、流式细胞仪检测周期显示TUG1低表达情况下滋养细胞的周期出现停滞7、流式细胞仪检测凋亡水平显示TUG1低表达情况下滋养细胞的凋亡水平增加结论:长链非编码RNA TUG1能够通过调控滋养细胞生物学行为参与子痫前期的发生发展。其对滋养细胞的调控为促进滋养细胞增殖、促进滋养细胞侵袭迁移、血管形成以及抑制凋亡。目的:1、明确长链非编码RNA TUG1在细胞内的定位2、明确长链非编码RNA TUG1在滋养细胞内所调控的基因种类3、明确长链非编码RNA TUG1在滋养细胞内所调控最突出靶基因4、明确长链非编码RNA TUG1在滋养细胞内调控基因的模式5、明确靶基因的功能并且验证方法:1、滋养细胞分离核RNA以及质RNA,分别检测TUG1的表达,对比观察其优势定位2、二代高通量RNA测序明确TUG1下游受控的基因类别(GO分析)3、分析测序数据寻找TUG1下游最可能的效应基因,即靶基因4、预测TUG1如何调控靶基因并且RIP验证其绑定蛋白5、预测TUG1如何调控靶基因并且Chi P验证其作用机制6、验证靶基因在子痫前期胎盘组织中的表达是否和测序结果一致7、验证靶基因在滋养细胞中的功能是否与TUG1一致8、补救实验再次验证靶基因的正确性结果:1、核质分离实验结果提示TUG1在细胞核中优势表达2、通过数据库预测TUG1结合蛋白后RIP验证,EZH2具有明显结合峰度3、分析二代高通量测序结果,GO分析TUG1下游受控基因大多与增值、迁移相关4、分析二代高通量测序结果,寻找最有可能的靶基因:RND3,再次验证5、CHip实验结果显示EZH2与RND3启动子区具有结合峰,且随着TUG1表达量的改变而改变6、验证RND3在子痫前期胎盘中的表达显示其在子痫前期胎盘组织中显著高表达7、RND3功能验证显示其促进细胞凋亡、周期停滞,抑制细胞增殖迁移能力结论:长链非编码RNA TUG1通过绑定EZH2保证RND3启动子区甲基化水平而抑制RND3表达。在子痫前期中这一过程因TUG1的表达减少而被打破,导致RND3表达上调,影响了滋养细胞的侵袭、迁移能力,导致细胞的过度凋亡,影响了螺旋动脉重铸,促进子痫前期发生。