脊髓灰质炎(简称脊灰)是一种由脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)引起的重大急性传染病,上个世纪50年代成功研制了 Salk灭活疫苗和Sabin 口服活疫苗,有效地降低了脊灰发病率。随着脊灰的流行得到很好的控制并接近根除阶段,世界卫生组织提出了从口服脊髓灰质炎疫苗(Oral polio vaccine,OPV)转向脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine,IPV)的接种策略,并建议新的疫苗生产厂家采用弱毒性的Sabin株生产IPV疫苗,以达到全球消灭脊灰的目标。PV有三个血清型,不同血清型病毒均由两种不同病毒颗粒组成:一种是致密(Density,D)抗原,为具有感染性的完整病毒颗粒;另一种是无核心(Coreless,C)抗原,为一种未成熟的空心病毒颗粒,IPV疫苗中有效性成分主要是D抗原。本研究对脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株C抗原和D抗原在形态、感染特性、核酸含量和结构基因核苷酸序列、不同结构蛋白质含量及两种抗原免疫原性等方面的差异进行比较观察,并建立定量检测脊灰Ⅲ型病毒D抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测体系。将脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株灭活或未灭活的病毒纯化液经过超滤浓缩及氯化铯密度梯度离心获得分离的C抗原和D抗原。采用透射电镜观察到C抗原呈空壳状态,D抗原呈实壳状态,并观察到C抗原群体中存在混杂的D抗原颗粒;聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果表明,C抗原外壳蛋白由VP0、VP1和VP3蛋白组成,D抗原外壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4蛋白组成,同质量的D抗原VP1含量是C抗原近1.7倍,C抗原的VP3含量是D抗原近3倍;采用D抗原特有的VP2条带为检测指标,对影响超离分离的C抗原纯度因素进行了观察,发现超速离心的原液蛋白浓度与收获的C抗原纯度具有负相关性,降低上样浓度可提高C抗原收获纯度;超速离心分离的C抗原经二次超速离心后,可提高抗原纯度。对二次分离的两批未灭活C、D抗原进行病毒滴度和核酸检测,结果表明每微克C、D抗原病毒滴度差值约为4个对数值。这个结果和电镜观察结果相近,在近万个C抗原组成群体中可发现2颗疑似D抗原颗粒。采用定量反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测C抗原和D抗原核酸含量,结果发现每微克C抗原经RT-PCR扩增后核酸含量与1/64微克D抗原扩增后核酸含量相当,因此评估C抗原VP1基因的有效核酸模板量仅为D抗原的1/64。对C抗原和D抗原结构基因序列测定结果显示,C抗原和D抗原结构基因核苷酸序列完全一致。将sPVⅢC抗原与D抗原分别按每只免疫2μg和8μg分组,并加入氢氧化铝佐剂初免和加强免疫大鼠,观察C、D抗原的免疫原性的差异。实验结果表明,初免第一周是抗体高峰,随后3周抗体逐渐降低,C抗原下降更快。C抗原诱导的中和抗体仅为D抗原的1/10～1/50。C抗原和D抗原加强免疫后,一般1到2周达到抗体峰值,较加强免疫前高出10～40倍。同剂量的D抗原较C抗原诱生的中和抗体高20～40倍,显示了 D抗原对IPV疫苗有效性的重要作用。采用灭活的sPVⅢD抗原分别免疫家兔和山羊,制备多抗血清,并对采集的血清分别与不同型脊灰病毒及sPVⅢC、D抗原的识别情况进行了检测,检测结果显示制备的抗血清具有良好的型特异性和D抗原识别特异性。采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多抗血清,过碘酸钠法对纯化后的多抗进行HRP的标记,采用夹心法用纯化抗血清组装检测试剂盒能够在2～16μg/mL抗原浓度范围内特异性检测PVⅢ型病毒,采用不同试剂盒检测了相同浓度的sPVⅢD抗原和C抗原,结果显示结合D抗原大大高于C抗原,检测差值大于2.0 OD值。试剂盒检测D抗原浓度和相应OD值的线性段相关系数大于0.99。建立了以羊多抗为捕获抗体,3#兔多抗-HRP为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测体系,并对该体系进行验证。该组合线性相关系数R2>0.99,线性检测范围为0.25～8 DU/mL,特异性良好,与sPVⅢD抗原之外抗原均无交叉反应。本实验对脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株C抗原和D抗原的生物学特性进行比较研究,为脊髓灰质炎疫苗C、D抗原的检测、鉴定及进一步的疫苗效力研究提供了实验依据。建立的双抗体夹心ELISA检测体系可应用于疫苗生产过程中sPVⅢD抗原含量的测定,为进一步建立完整的疫苗抗原检测体系奠定了基础。