【摘 要】
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本试验以湖羊为研究对象,根据GenBank中己知的小鼠、人等的Lats2基因序列的CDS区设计引物,利用基因克隆技术克隆出湖羊Lats2基因的CDS区序列。对获得的Lats2基因CDS区序列进
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本试验以湖羊为研究对象,根据GenBank中己知的小鼠、人等的Lats2基因序列的CDS区设计引物,利用基因克隆技术克隆出湖羊Lats2基因的CDS区序列。对获得的Lats2基因CDS区序列进行了生物信息学分析,分析了与其它物种的同源性,预测其蛋白的二级结构及其理化性质等。利用载体构建和细胞转染技术,成功构建了pEGFP-C1-Last2真核表达载体,并转染湖羊骨骼肌卫星细胞,探究Lats2基因过表达后的骨骼肌卫星细胞变化。利用荧光定量PCR技术,分析了Lats2基因在湖羊不同性别、不同生长阶段、不同肌肉组织中的相对表达。本研究为探讨Lats2基因在湖羊骨骼肌发育过程中的机制提供了理论基础。本研究获得了以下结果:1.成功获得湖羊Lats2基因CDS区全长3048bp,包含了起始密码子ATG和终止密码子TAG。同源性分析发现,湖羊Lats2基因序列与野猪、人、家鼠、褐鼠、非洲爪蟾和斑马鱼的同源性分别为82.2%、78.0%、75.3%、74.9%、58.9%、36.1%;氨基酸序列同源性为80%、75.6%、72.9%、73.3%、56.3%、61.0%;其编码1016个氨基酸,分子量为110398.2Da,其蛋白为不稳定蛋白,无潜在的信号肽剪切位点;其蛋白包含2个从内向外的强跨膜螺旋区,6个从外向内的6个强跨膜螺旋区,存在4个潜在的糖基化位点和45个磷酸化位点,亚细胞定位主要存在于细胞核,有1个S-TKc、1个S-TK-X结构域;2.Lats2基因在湖羊肌肉中的时空表达分析中,Lats2基因在趾长伸肌中的相对表达最高;在不同生长阶段的表达分析中,Lats2基因在二日龄中表达最低,二月龄、六月龄表达相对较低;在不同性别相对比较中,表现为公羊的相对表达量高于母羊;Lats2基因与Lats、 YAP1、MSTN、MyoG、MyHC Ⅰ、MyHC ⅡA和MyHC ⅡX基因的关联分析结果中表明,Lats2基因可能与肌肉生长发育存在一定的联系;3.成功构建了Lats2基因的真核表达载体pEGFP-C1-Lats2,并成功的将Lats2和Lats1基因真核表达载体转染到湖羊骨骼肌卫星细胞中,并在细胞中表达。过表达Lats2后,发现Lats1、MSTN、MyoG基因的表达增加,而YAP1、MyHC Ⅰ、MyHC ⅡA、MyHCⅡX基因的表达下降,但均差异不显著(P>0.05);过表达Lats1后Lats2基因的表达增加,而YAP1、MSYN、MyoG、MyHC Ⅰ、MyHC ⅡA和 MyHC ⅡX基因的表达下降,但均差异不显著(P>0.05)。
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