紫杉醇能促进细胞微管形成并能阻止其生理解聚，从而避免了癌细胞的快速分裂，使其停止在G2期和M期，直到死亡。它具有广谱抗肿瘤活性，特别对治疗转移性卵巢癌、乳腺癌疗效显著，被公认为非常有发展前途的抗癌药物。但紫杉醇口服吸收较差，故临床采用紫杉醇注射液，但该注射液含有50％的增溶剂(cremophor EL，聚氧乙烯蓖麻油)，在体内可引起较严重的急性过敏反应，且发生率较高。 制约紫杉醇口服制剂发展的重要原因是紫杉醇在动物体内口服吸收差。因此，许多研究机构在水溶性、稳定性和生物利用度方面做了不同程度的改善，并尝试开发新剂型与新给药途径，如关节腔注入、多聚型配方、环糊精包合物、脂质体、静脉乳等。但到目前为止仍没有一种制剂可以完全取代紫杉醇注射液。 进一步的研究证实，消化道膜P糖蛋白(P-gp)作用和肝细胞色素P450代谢酶是导致紫杉醇吸收差的主要原因。P-gp是由ATP水解而始动的能量依赖的底物外向转运泵，能将底物转运出细胞，从而降低细胞内底物浓度。而作为P-gp底物的紫杉醇，将被过度表达的P-gp主动泵出，使紫杉醇在肿瘤细胞内的积累减少，产生耐药性，导致治疗失败。Van Asperen等证实环孢素A具有阻滞P-gp作用，并且为肝细胞色素P450 3A4代谢酶的底物，与紫杉醇同服后可通过双重机制阻滞作用，增加药物的吸收和延缓代谢。但由于环孢素A具有免疫抑制作用，使其作用受到限制。 淫羊藿提取物，是从小蘖科淫羊藿属植物茎叶中提取的多种黄酮类成分，具有促进免疫功能、参与骨代谢，抗肿瘤、增强心血管活动、补肾壮阳、延缓衰老等多方面的药理作用。此前的研究中，中山大学药学院自行提取和分离了数种淫羊藿提取物，并发现其中的几种成分，具有很好的抑制P-gp活性作用。而它们是否可用于提高紫杉醇的口服吸收，值得进一步研究。 在本研究中，我们建立了Caco-2细胞单层模型并进行了验证，应用Caco-2模型对淫羊藿提取物进行初步筛选后，再进行大鼠体内药代动力学的研究。 基于以上所述，本实验分为以下四个部分： 1.含4％BSA的HBSS及大鼠血浆中紫杉醇HPLC分析方法的建立； 2.Caco-2细胞单层模型的验证； 3.紫杉醇联合淫羊藿提取物在Caco-2细胞单层模型中的转运研究； 4.紫杉醇联合淫羊藿提取物在大鼠体内的药代动力学研究。 第一部分： HBSS及大鼠血浆中紫杉醇HPLC分析方法的建立。 目的：建立含4％BSA的HBSS及大鼠血浆中紫杉醇的HPLC分析方法。 方法：含4％BSA的HBSS样品及血浆样品以叔丁基甲醚(3：1，v/v)进行液．液萃取，取有机层，真空挥干后甲醇重溶，HPLC进样分析。色谱条件：流动相为甲醇．乙腈．水(23：37：40)，含0.5％冰醋酸。内标物：地西泮(Diazepam)，终浓度20μg·mL-1。流速：1 ml·min-1。色谱柱：Hypersil ODS C18色谱柱(150mm×4.6 mm,5μm)。柱温：室温。紫外检测波长：227 nm。 结果：含4％BSA的HBSS中标准曲线范围为0.078 gg μg·mL-1～20 μg·ml-1，回归方程为：y=0.1785x+0.016，r2=0.9998；提取回收率为80.5％～90.7％(n=5)，方法回收率为95.7％～99.1％，RSD≤10.9％(n=5)；批内RSD ≤6.48％，批间RSD ≤13.47％。血浆中标准曲线范围为0.017 μg·mL-1～5 μg·mL-1，回归方程为：y=0.296x-0.0134，R2=0.9986；提取回收率为46.5％～60.9％(n=5)，方法回收率为95.7％～104.9％，RSD ≤ 11.4％(n=5)；批内RSD ≤ 4.24％，批间RSD ≤12.54％. 结论：本分析方法灵敏、准确、重复性好，为紫杉醇非临床药代动力学研究中样品的检测提供了可靠的方法。 第二部分：Caco-2细胞单层模型的验证。 目的：建立Caco-2细胞模型，验证其在药物吸收研究方面的可靠性。 方法：按照文献报道方法，将细胞接种在12孔Transwell(ComingCostar，Cambridge，MA，LISA)板上，接种密度为每孔2×105，。Yranswell板BL侧加入DMEM培养液1.5 mL，第一周隔天换液，一周后每天换液。培养约21天后，采用荧光黄、普萘洛尔、维拉帕米三种标准的标记物，在模型中进行转运试验。对模型的完整性、通透性以及P-gp的表达进行验证，将结果与文献报道值比较。 结果：细胞旁转运的标记物荧光黄表观渗透系数值(Papp)为6.3×10-6 cm·sec-1，在文献报道值范围之内。跨细胞被动转运的标记物普萘洛尔的Papp值为24.0×10-6cm·sec-1，与文献报道值接近。P-gp的标准底物维拉帕米在模型中的外排能被P-gp的强抑制剂酮康唑抑制，P<0.05。 结论：本研究建立的Caco-2细胞单层模型在模型完整性、通透性以及P-gp的表达方面能够满足化合物在小肠吸收研究的需要。 第三部分：淫羊藿提取物联合紫杉醇在Caco-2细胞模型中的研究。 目的：研究淫羊藿提取物对紫杉醇在Caco-2细胞模型中吸收的影响。 方法：用Caco-2细胞单层模型研究紫杉醇的双向转运，并考察不同淫羊藿提取物和P-gp抑制剂维拉帕米及酮康唑对紫杉醇吸收的影响。用HPLC法检测药物浓度，并计算其Papp，计算外排比率(Efflux ratio)。 结果：不同浓度的紫杉醇在Caco-2细胞模型中，从肠腔侧(AP)到基底膜(BL)的Papp为2.38～8.59×10-6 cm·sec-1；从Caco-2单层细胞基底膜(BL)到肠腔侧(AP)的表观渗透系数为18.12～94.06×10-6cm·sec-1BL侧→AP侧的Papp值为AP侧→BL侧的7.6～10.9倍。3小时内AP侧→BL侧的药物吸收随时间和浓度的增加无饱和趋势，P-gp抑制剂维拉帕米、酮康唑、淫羊藿提取物A、B、Y能使紫杉醇的外排比率分别降低至48.4％、65.2％、69.4％、85.6％和86.7％。 结论：在Caco-2细胞模型中，紫杉醇AP侧→BL侧的转运受到的P-gp的外排作用，可被P-gp抑制剂维拉帕米、酮康唑、淫羊藿提取物所抑制。在淫羊藿提取物中，提取物A的抑制效果最佳。 第四部分：淫羊藿提取物联合紫杉醇在大鼠体内的药代动力学研究。 目的：研究淫羊藿提取物A对大鼠体内紫杉醇药代动力学的影响，并探讨其原因。 方法：空白对照组，SD大鼠单次灌胃给予紫杉醇混悬液(30 mg·kg-1)。淫羊藿提取物A组，灌胃给予淫羊藿提取物A30 min后，再灌胃给予紫杉醇混悬液。按实验设计时间点从大鼠右颈静脉采血，HPLC法检测血浆中紫杉醇浓度，并计算药代动力学参数。 结果：统计学分析结果显示，联合应用淫羊藿提取物A后，Tmax、Cmax与对照组比较无统计学差异，而AUC0-t、MRT’、CL/F较对照组则呈现显著性差异，AUC0-t、MR]均有所提高，而表观清除率CL/F则有所下降。 结论：淫羊藿提取物A能提高紫杉醇的口服吸收，但这种改善作用有限。