神经母细胞瘤是一种常见的恶性肿瘤,由儿童交感神经系统发育而来,通常发生在5岁以前。神经母细胞瘤的症状包括腹部肿块、疼痛、腹泻或一般不适感。神经母细胞瘤死亡率占儿童肿瘤相关死亡人数的12%。了解神经母细胞瘤发生和发展的确切机制,将有助于改善对这个知之甚少的肿瘤预防和治疗策略。在本论文中,我们发现内质网钙稳定蛋白CHERP参与调控神经母细胞瘤细胞增殖、细胞凋亡和致瘤性等过程。本研究发现,下调CHERP蛋白能够引起细胞发生内质网应激反应,从而导致DR5表达和激活,并且抑制AKT/m TOR信号通路,最终导致细胞凋亡。此外我们使用内质网应激反应特异性抑制剂GSK2606414能够部分挽救由干扰CHERP引起的细胞凋亡。实验表明干扰CHERP能够触发神经母细胞瘤细胞内质网应激反应引起下游ATF4/CHOP/DR5通路激活并抑制AKT/m TOR信号通路从而诱导神经母细胞瘤发生凋亡反应。本研究结果表明CHERP可能为神经母细胞瘤病人临床诊断提供潜在靶点并制定新的治疗策略。本论文主要研究结果如下:1.在神经母细胞瘤病人中CHERP高表达与患者预后差有关为了研究CHERP的异常表达是否与神经母细胞瘤患者预后有关,我们利用网络资源R2数据库:基因组分析和可视化平台检索CHERP在神经母细胞瘤公共数据库(Tumor Neuroblastoma public database)中表达情况。我们使用了3个常用的数据库(Versteeg,Kocak和Asgharzadeh),这3个数据库分别包含有88,476和247例神经母细胞瘤患者,利用这3个数据库预测CHERP与神经母细胞瘤患者预后的关系。Kaplan–Meier分析,CHERP表达量高,神经母细胞瘤患者整体存活率低,CHERP表达量低,神经母细胞瘤患者整体存活率高。其次,在Versteeg数据库中分析发现,肿瘤患者死亡情况、诊断年龄和致死原因都与CHERP表达水平有关。此外,我们还分析了CHERP表达水平是否与原癌基因MYCN有联系。结果显示,在MYCN扩增的患者人群CHERP表达水平明显高于非扩增人群。这些结果暗示CHERP可能是一个神经母细胞瘤患者的潜在的诊断标记。为了进一步验证以上结果,我们还利用了另一个网络数据库资源:原癌基因数据库(Neuroblastoma Prognosis Database),Kaplan–Meier分析同样显示高水平的CHERP与神经母细胞瘤不良预后有关。此外在Kocak数据库中还发现,恶性程度最高的IV期肿瘤中CHERP表达水平显著高于其他时期肿瘤。以上结果表明,高水平的CHERP蛋白与神经母细胞瘤患者整体生存率及预后有关,因此我们推断CHERP可能作为神经母细胞瘤患者诊断的一个标志物。2.CHERP在神经母细胞瘤细胞系高表达且定位于细胞核为了研究CHERP在神经母细胞瘤中的表达情况,我们首先利western blotting和q RT-PCR检测了CHERP在6种神经母细胞瘤细胞系中表达量。我们发现CHERP在6种神经母细胞瘤细胞系中普遍表达,在BE(2)-C表达量最高,在SHEP1细胞中表达量最低。前人研究报道显示在大鼠肌肉细胞中CHERP与Ry R1结合并定位在肌浆网,而最新的报道显示在HEK293和SKBR3细胞系中CHERP扮演核蛋白作用,影响细胞增殖。为了确认CHERP在神经母细胞瘤细胞系中的具体表达位置,我们抽提了细胞浆蛋白和细胞核蛋白。western blotting结果显示在BE(2)-C,SK-N-DZ和SHEP1 3个细胞系中,CHERP只定位在细胞核,细胞质中未能检测到目的蛋白。进一步通过免疫荧光实验发现CHERP只定位于细胞核,细胞质中未检测到信号。这些结果显示,CHERP在神经母细胞瘤细胞系中普遍表达,而且定位于细胞核内。3.干扰CHERP抑制神经母细胞瘤细胞增殖为了研究CHERP在神经母细胞瘤的中的重要性,我们应用携带小发夹RNA(sh RNA)的慢病毒系统构建了靶向干扰CHERP的重组质粒(CHERPsi-1#,CHERPsi-2#和对照组GFPsi)感染BE(2)-C和SHEP1细胞系。通过western blotting和q RT-PCR分析重组载体能有效的下调CHERP水平。干扰CHERP后,细胞数量显著性下降,细胞形态也发生改变。进一步通过CCK-8生长曲线实验也验证了干扰CHERP能够显著抑制细胞生长增殖这一结论。这些结果显示CHERP在神经母细胞瘤细胞增殖过程扮演不可缺少的角色。4.干扰CHERP诱导神经母细胞瘤细胞周期阻滞在G0/G1期前文数据表明干扰CHERP抑制神经母细胞瘤增殖,而许多证据表明细胞增殖往往与细胞周期有密切联系。因此,我们利用流式细胞术检测了BE(2)-C和SHEP1干扰CHERP后细胞周期变化情况。结果显示与GFPsi对照组相比,干扰CHERP能够显著增加G0/G1期细胞比例,S期细胞比例显著降低。此外,我们利用增殖标志物Ki-67去标记细胞发现与对照组相比,CHERP干扰后Ki-67阳性细胞比例显著降低,说明细胞增殖受到抑制。为了验证以上结果,我们使用western blotting检测了G0/G1细胞周期检验点相关蛋白表达情况。实验结果显示干扰CHERP后,细胞内CDK2和Cyclin E蛋白水平显著降低,而CDK1,CDK4和Cyclin B1蛋白表达水平没有明显变化。这些结果证明了干扰CHERP能够通过降低CDK2和Cyclin E表达水平从而诱导细胞周期阻滞在G0/G1时期,导致神经母细胞瘤细胞增殖受到抑制。5.干扰CHERP诱导神经母细胞瘤细胞凋亡细胞凋亡可能导致细胞增殖抑制及肿瘤生长抑制,所以我们检测了干扰CHERP是否导致诱导细胞发生凋亡反应。首先通过Hoechst 33258染色,发现对照GFPsi组细胞细胞核具有大而圆亮的细胞核膜,而干扰CHERP的实验组细胞核出现亮蓝色碎片,暗示干扰CHERP可能够诱导神经母细胞瘤细胞凋亡。量化细胞核碎片所占比例发现与GFPsi组相比,干扰CHERP导致细胞核碎片比例大幅增加。进一步用FITC Annexin-V和PI染色后用流式细胞仪检测发现干扰CHERP后凋亡细胞数目显著的增加。下一步,我们应用western blotting检测了凋亡相关蛋白表达水平。发现干扰CHERP后Cle-caspase-3和Cle-caspase-8大幅上调。这些结果显示了干扰CHERP能够诱导神经母细胞瘤细胞凋亡。6.干扰CHERP导致神经母细胞瘤细胞活力降低及对抗肿瘤药物敏感性增加肿瘤的一大特征就是其具有耐药性。我们接下来研究了干扰CHERP是否影响神经母细胞瘤细胞对抗肿瘤药物doxorubicin(Dox)的敏感性。我们用2 u M Dox处理神经母细胞瘤细胞,发现与对照组相比,经过Dox药物处理后BE(2)-C和SHEP1细胞形成克隆明显减少,说明干扰CHERP能够损坏细胞对Dox的耐药性。此外,western blotting结果也显示,干扰CHERP后,经过Dox处理组Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平显著增加。这些结果表明干扰CHERP能够削弱神经母细胞瘤细胞药物敏感性及降低细胞活力。7.干扰CHERP抑制AKT/m TOR信号通路活性,并通过CHOP/DR5通路诱导神经母细胞瘤细胞凋亡前文研究发现干扰CHERP能诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,增加Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平。文献报道大部分神经母细胞瘤细胞表现出耐药性是由于其低表达caspase-8蛋白,同时有文献报道肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2(TRAIL-R2/DR5/TNFRSF10b)是caspase-8的一个上游调控原件。因此我们检测了干扰CHERP蛋白后DR5表达水平变化。与我们预期结果一致,干扰CHERP后DR5蛋白水平和m RNA水平显著增加。据报道,肿瘤细胞内质网应激反应(ERS)能够诱导DR5转录翻译。为了研究在神经母细胞瘤细胞中DR5转录翻译是否受到ERS调控,我们检测了ERS相关的标志蛋白BIP,ATF4和CHOP。发现干扰CHERP,BIP,ATF4和CHOP蛋白水平显著增加,暗示ERS参与到干扰CHERP所诱导的细胞凋亡过程。为了进一步确认这个结论,我们应用了ERS特异性抑制剂GSK2606414处理细胞,实验结果显示Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平相对阴性对照组显著降低,CHOP和DR5蛋白水平也有所降低。此外本研究还发现发现m TOR和AKT磷酸化水平都显著降低,暗示AKT/m TOR信号通路参与到干扰CHERP诱导细胞凋亡过程。这些结论暗示ERS和AKT/m TOR信号通路参与到由干扰CHERP所引起的细胞凋亡过程,并且DR5在此过程扮演重要角色。8.干扰CHERP抑制神经母细胞瘤细胞的体外克隆形成能力以及抑制细胞体内成瘤能力为了研究干扰CHERP是否对神经母细胞瘤成瘤能力有影响,我们首先采取了了软琼脂单克隆实验进行研究。结果显示干扰CHERP后细胞形成的单克隆数目和大小都有所减小。此外我们利用免疫缺陷鼠研究了CHERP与神经母细胞瘤细胞成瘤能力的影响,结果显示干扰CHERP的BE(2)-C细胞在小鼠皮下未能形成肿瘤。这些结果暗示,CHERP与神经母细胞瘤细胞克隆形成能力和肿瘤形成能力有密切联系。MYCN是一个经典的原癌基因,高水平的MYCN往往与恶性神经母细胞瘤有关,也预示着患者临床预后不好。根据我们数据库分析显示,在MYCN扩增患者人群CHERP也显著高于非MYCN扩增人群,为了验证这一结论,我们在神经母细胞瘤细胞系检测了MYCN与CHERP表达水平是否存在联系。我们发现干扰CHERP过后,MYCN蛋白水平显著降低。