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麦芽三糖生成酶是一种由蛾微杆菌(Microbacteriumimperiale)产生的淀粉酶,能直接水解淀粉,是制备麦芽三糖的理想酶制剂。目前麦芽三糖及制备麦芽三糖所使用的酶制剂的生产技术均被国外大公司垄断。本课题以蛾微杆菌作为研究对象,主要从菌株的诱变选育,发酵工艺优化与麦芽三糖生产工艺三个方面进行。(1)以蛾微杆菌Mebl-012为出发菌株,进行常压室温等离子体(ARTP)诱变,并根据菌株菌落形态进行初筛,经发酵复筛后,得到了一株正突变株Metp-57,其麦芽三糖生成酶的产量可达到12.06 U/mL,较出发菌株Mebl-012的产量5.82U/mL,提高了 107.26%。然后以Metp-57作为出发菌株,进行紫外诱变,最终筛选得到了一株高产菌株Metu-24。该菌株的摇瓶实验结果表明,其麦芽三糖生成酶的产量可达到20.42 U/mL,较出发菌株Mebl-012的产量,提高了 257.31%,且遗传稳定性良好。(2)以高产菌Metu-24作为研究对象,对其发酵工艺进行了优化。首先通过单因素实验以及响应面优化的方法,对其发酵培养基进行了优化,得到的最佳培养基配方为:可溶性淀粉 17.96 g/L,麸皮 15.78 g/L,NaNO3 1.51 g/L,K2HPO4 2 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,Na2HPO4 1 g/L,CaC12 1 g/L,pH 7.0-7.2。经发酵验证,麦芽三糖生成酶的产量可达到34.71 U/mL,比优化之前提高了 71.07%。然后在此基础上对摇床上的发酵工艺进行了优化,得到最适的发酵培养条件为:装液量80 mL,接种量5%,培养温度30℃,培养基初始pH值为7.0,摇床转速150 r/min。最后对5 L发酵罐上的发酵条件进行了初步摸索,在装液系数为60%的5 L发酵罐中,通气比为1:1(v/v),罐压为0.03 MPa的发酵条件下,确定了溶氧30%,发酵中期恒定pH在6.8的初步发酵工艺。在优化的发酵条件下,麦芽三糖生成酶可达到56.71 U/mL,高于摇瓶发酵水平,且比相同发酵条件下不控制pH的产量45.82 U/mL,提高了 23.76%。(3)麦芽三糖生成酶的分子量约为55 KDa。酶的最适作用温度为55℃,酶的最适pH为6.5,在70℃下保温4h酶活接近完全丧失,在pH 6.0-7.0时酶活较稳定。Ca2+对其起促进作用,而Ni2+和Fe3+严重抑制酶的活力。经圆二色光谱测定蛋白二级结构为,不含有α-螺旋和β-螺旋,其中α-折叠、β-折叠、转角、无序卷曲分别含有1.4%、9.5%、28.4%、60.8%。当酶与底物接触后,酶的蛋白结构发生了一定变化,α-螺旋、β-螺旋、α-折叠、β-折叠、转角、无序卷曲的含量分别为21%、13.5%、4.3%、6.7%、23.1%、31.3%。(4)以筛选得到麦芽三糖生成酶为基础,对麦芽三糖的制备工艺进行了优化。得到的麦芽三糖优化工艺条件为:以20%可溶性淀粉为底物,pH调到6.1,然后添加1.5U/g干淀粉的麦芽三糖生成酶,麦芽三糖生成酶与普鲁兰酶的添加比例为1.5:1,于57℃反应48h,淀粉转化率为55.18%,麦芽三糖在糖浆中含量为57.25%。