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海洋中存在着种类繁多的微生物类群,是获取新药和新酶的宝贵资源,具有很好的开发前景。极端环境微生物是微生物学领域中研究的热点,适冷菌是极端微生物中的一类,在海洋中广泛分布,是分离适冷酶的良好材料。适冷酶在低温下具有较高的催化效率,在需要低温催化的行业如洗涤、食品、奶制品、皮革加工、医药和化妆品中具有较高的应用价值,因而引起各国科学家的广泛关注。
本文通过透明取法初筛,得到产淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶复合酶的菌株3株。然后通过摇瓶液态发酵和产酶测定,筛选出一个比较优异的复合酶产生菌株-1-3。
对菌株1-3进行鉴定,菌株的表型、生理生化特征和16SrDNA序列结果表明这株菌株属于假单胞菌属,命名为Pseudomona sp.1-3。
分别研究了不同碳源、氮源、无机盐、脂肪酶作用底物、接种量、培养基起始pH、以及培养温度和时间对1-3发酵产酶的影响,发现氮源、碳源有利于菌体产酶,蛋白胨可作为菌体产酶的最佳氮源,产复合酶活力最高;当以1%的葡萄糖作为碳源时,菌体产复合酶能力增强;金属离子Ca2+、K+对酶有不同程度的激活作用;添加油脂对产复合酶的影响不大;接种量为10%时,菌株产酶能力最强,接种量增加,产酶能力下降;培养基初始pH值在6-11时对产酶影响不大,在pH8.5时产复合酶能力最强。通过摸索不同发酵温度和时间,发现该菌在28℃培养72h可达最大产酶值。
在摇瓶发酵水平上进行产酶优化试验,确定1-3产复合酶的最佳培养方案为:以1%葡萄糖为碳源,以0.5%蛋白胨为氮源,无机盐:0.075%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.5%CaCO3,起始pH值为8.5,接种量为10%,28℃、150r/min的条件下在摇床中培养72h。
对1-3的粗酶酶液,进行酶学性质研究。淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的最适反应温度分别为30℃、40℃和45℃;淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的最适pH值分别为6.0、9.0和9.0。淀粉酶30℃温浴30min后仍有80%以上的酶活,脂肪酶在40℃下保温60min,酶活力仍有80%左右,蛋白酶在30℃时最稳定,酶活可保留90%;淀粉酶酶在pH值6.0~7.0左右范围内较稳定,脂肪酶在pH7.0~10.0的范围内,酶活性维持在80%以上,蛋白酶在pH值范围8.0~11.0内酶活力均较高。综上,该菌株所产酶类比较适于在实际生产中应用。