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研究目的:1.研究症状性迟发性性腺功能减退症(symptomatic late onset hypogonadism,sLOH)患者的中医体质证候。2.研究人体慢性间歇性缺氧与sLOH之间的相关性。3.构建及评判慢性间歇性缺氧诱发迟发性性腺功能减退症(late onsethypogonadism,LOH)动物模型。4.传承名老中医经验,研究以补肾活血为主要治则的“益精方”对慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠治疗效果;从睾丸间质细胞(Leydig)凋亡、睾丸病理组织学改变及Leydig细胞超微结构改变探讨其作用机制。研究方法:第一部分:采用横断面研究的方法,以自填问卷的形式,收集在中国中医科学院广安门医院男科就诊的伴有鼾眠表现的sLOH患者的病例资料。采用Epworth嗜睡量表、STOP-bang问卷测评嗜睡状态,采用精简版AMS(cAMS)筛查量表测评LOH症状,中医体质分类与判定表测评中医体质,测定静脉血男性激素和乳酸。运用Pearson相关性分析,对血乳酸、性激素与sLOH症状、嗜睡状态进行相关性分析。第二部分:运用Attendor动物气体控制系统(Pro版),模拟慢性间歇性低氧模式,对50只40周龄的退役SD种鼠进行每日4小时,连续30天的低氧干预,设为模型组;设10只40周龄的退役SD种鼠为对照组;设10只8周龄的SD大鼠为正常组。在造模第15天、30天时,随机选取模型组中的10只大鼠,与对照组、正常组大鼠,采血,进行血清总睾酮(TT)、游离睾酮(FT)和乳酸检测。在造模第30天时,随机选取模型组中10只大鼠与对照组、正常组大鼠,进行大鼠悬尾实验和大鼠强迫游泳实验;结合血清TT、FT和乳酸水平评估造模效果。第三部分:选取造模成功的32只LOH模型大鼠,随机分成4组:模型组,益精方高、中、低剂量组,每组8只大鼠。继续运用Attendor动物气体控制系统(Pro版)对大鼠进行慢性间歇性低氧的干预,为期4周,同时灌胃4周。模型组大鼠按体重灌胃蒸馏水。低剂量组予以0.324g/mL的益精方水煎剂;中剂量组予以0.75g/mL的益精方水煎剂;高剂量组予以1.5g/mL的益精方水煎剂。4周结束后,采血,ELISA法测血清TT、FT;比色分析法测血乳酸值;将大鼠断颈处死,计算大鼠睾丸指数;细胞流式术检测睾丸Leydig细胞凋亡率;Western印迹检测睾丸组织Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测睾丸组织Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平;分别以光学显微镜和透射电子显微镜观察睾丸病理组织学改变与超微结构的变化。研究结果:第一部分:sLOH患者排名前三的中医体质证候为气虚、痰湿、血瘀。41例sLOH患者完成了男性激素和乳酸检测,其中20例乳酸水平正常,21例乳酸水平高于正常,异常乳酸值范围为2.15-3.18(2.60±0.29)mmol/L,sLOH患者血乳酸异常比例约为51%。其中乳酸水平正常者气虚为主,乳酸水平增高者痰湿为主,但无论乳酸水平正常与否,血瘀均是sLOH患者比较突出的体质证候。Pearson相关性分析显示:Epworth评分与STOP-bang评分之间呈正向的强相关,r=0.681;cAMS评分与Epworth评分之间呈正向的弱相关,r=0.394;cAMS评分与STOP-bang评分之间呈正向的弱相关,r=0.311。Epworth评分与cAMS性功能症状分呈正向弱相关,r=0.317;Epworth评分与cAMS自主神经紊乱症状分呈正向中等强度相关,r=0.531;Epworth评分与cAMS心理和躯体症状分呈正向中等强度相关,r=0.460;STOP-bang评分与cAMS性功能症状分呈正向弱相关,r=0.357;STOP-bang评分与cAMS自主神经紊乱症状分呈正向弱相关,r=0.266;STOP-bang评分与cAMS心理和躯体症状分呈正向中等强度相关,r=0.434。乳酸正常sLOH组与乳酸升高sLOH组两组间,在年龄、Epworth嗜睡量表评分、STOP-bang问卷评分、cAMS评分、男性激素各项指标及TSI指数上的差异无统计学意义(P>0.05);缺氧高中低风险3组,年龄在缺氧中风险组和缺氧低风险组之间存在统计学差异(P<0.05),血雄烯二酮在缺氧高风险组和缺氧低风险组之间存在统计学差异(P<0.05),其余指标在各组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分:与正常组和对照组相比,模型组大鼠造模第15天、第30天时2次检测的血清TT、FT水平均显著下降(P<0.05),差异具有统计学意义。与正常组和对照组相比,模型组大鼠2次检测的血乳酸水平均显著增高(P<0.05),差异具有统计学意义。造模第30天时悬尾实验:与正常组大鼠相比,对照组和模型组6min内不动时间均明显延长(P<0.05),具有统计学意义;模型组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。游泳实验:与正常组和对照组相比,模型组大鼠游泳至力竭的时间均明显缩短(P<0.05),差异具有统计学意义。依据LOH动物模型判定办法,以慢性间歇性缺氧为干预手段进行LOH动物模型构建,造模成功率为68%,造模途中死亡率为32%。第三部分:血TT、FT水平:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组大鼠血TT、FT水平均显著增高(P<0.05),呈剂量依赖性。血乳酸水平:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组大鼠血乳酸水平均显著下降(P<0.05),呈剂量依赖性。睾丸Leydig细胞凋亡率:与模型组相比,益精方中、高剂量组大鼠Leydig细胞凋亡率均显著下降(P<0.01),具有显著统计学意义;益精方低剂量组与模型组相比,P>0.05,无明显统计学意义。Caspase-3蛋白表达水平方面:与模型组相比,低、中、高剂量组均显著下调(P<0.01),低剂量组VS中剂量组,中剂量组VS高剂量组,P均>0.05;低剂量组VS高剂量组,P<0.01。Bcl-2蛋白表达水平方面:与模型组相比,益精方高剂量组Bcl-2蛋白表达水平显著上调(P<0.05),差异具有统计学意义;低、中剂量组VS模型组,P均>0.05,低剂量组VS高剂量组,P<0.05。Bax蛋白表达水平方面:与模型组相比,益精方中、高剂量组Bax蛋白表达水平均显著下调(P<0.01),差异具有显著统计学意义。低剂量组VS模型组,P>0.05;低剂量组VS高剂量组,P<0.05;中剂量组VS高剂量组,P>0.05。Caspase-3的mRNA表达水平方面:与模型组相比,低、中、高剂量组Caspase-3的mRNA表达水平均显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义;低剂量组VS高剂量组(P<0.01),其余剂量组之间P均>0.05。Bcl-2的mRNA表达水平方面:与模型组相比,益精方高剂量组Bcl-2的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),差异具有统计学意义;中、低剂量组VS模型组(P>0.05);低剂量组VS高剂量组(P<0.05)。Bax的mRNA表达水平方面:与模型组相比,益精方中、高剂量组Bax的mRNA表达水平均显著下调(P<0.01),差异具有显著统计学意义;低剂量组VS高剂量组(P<0.05),其余剂量组之间P均>0.05。光学显微镜下睾丸Leydig细胞数量:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组均有升高,但低、中、高剂量组组间差异不大。发生凋亡改变的Leydig细胞数量,益精方低、中、高剂量组均少于模型组。益精方低、中、高剂量组Leydig细胞形态优于模型组,其中高、中剂量组Leydig细胞形态趋近正常。透射电子显微镜下,4组大鼠的睾丸Leydig细胞超微结构在脂滴形成上有所差异。研究结论:1.在伴有鼾眠表现的sLOH患者中存在血乳酸异常升高;sLOH患者缺氧的风险越高,其LOH症状越重;缺氧对sLOH患者自主神经紊乱症状、心理和躯体症状的影响较明显,对男性激素的影响相对不明显。提示慢性间歇性缺氧可能是LOH的重要潜在危险因素。sLOH患者的中医体质证候以气虚、痰湿、血瘀为主,其中乳酸水平正常者倾向于气虚,乳酸水平增高者倾向于痰湿。提示肾气虚夹痰湿、血瘀可能是sLOH较为关键的中医病因病机。2.增龄与慢性间歇性缺氧,都是大鼠血TT、FT水平下降的危险因素;增龄加上缺氧,较单一的增龄因素,对大鼠血TT、FT水平的影响更为显著。以慢性间歇性缺氧为干预手段进行LOH动物模型构建,造模成功率较高,造模方法切实可行。3.益精方能明显提高慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠血TT、FT水平,降低血乳酸水平,降低睾丸Leydig细胞的凋亡率。其可能的作用机制在于:1)下调LOH模型大鼠睾丸组织中的Caspase-3、Bax的基因和蛋白表达,上调Bcl-2的基因和蛋白表达,调控了睾丸Leydig细胞的凋亡;2)改善LOH模型大鼠氧代谢,减轻乳酸蓄积,恢复雄激素合成睾丸内调节的正常环境,促进睾丸Leydig细胞分泌功能。