论文部分内容阅读
非编码RNA(ncRNA)是一大类无蛋白编码能力的RNA的总称,在基因表达调控过程中发挥着重要作用。微小RNA(microRNA,miRNA)与长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是两大主要类群,它们介导了转录、转录后及翻译等多个层次的基因表达调控。一些lncRNA可以作为miRNA前体发挥作用,另外一些lncRNA可以作为miRNA的竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)发挥作用。本课题在实验室前期构建的家蚕lncRNA文库的基础上,选择两个lncRNA,一个可以作为miRNA的前体产生多个miRNA,一个与miRNA序列互补作为竞争性内源RNA,研究miRNA与lncRNA在家蚕变态发育过程中的调控机制。为利用lncRNA和miRNA对家蚕进行转基因改良提供理论依据。本课题首先研究了lncRNA、miRNA及miRNA靶基因在家蚕不同发育时期及不同组织中的表达谱,研究三者之间的互作关系。其次通过家蚕个体及细胞实验探索lncRNA通过miRNA参与家蚕变态发育的分子机制。主要研究结果如下:1.lncRNA与miRNA在家蚕变态发育过程中的表达谱。以家蚕变态发育不同阶段的总RNA为研究对象,利用实时荧光定量PCR的方法,研究lncR-6496、lncR-26319、miR-2817和miR-2834在家蚕变态发育过程中的表达谱。结果表明,与miR-2817和miR-2834产生于同一基因座位的lncR-6496与两个miRNA在家蚕变态发育过程中存在着一致的表达趋势,在幼虫发育阶段,表达趋势不明显;在成虫及蛹发育阶段,呈现先下降后上升的趋势。产生于miR-2817和miR-2834互补链的lncR-26319与两个miRNA在家蚕变态发育过程中存在着相反的表达趋势,在幼虫阶段lncR-26319表达量先减少再逐步增加,到5龄时达到最高;两个miRNA二龄时最高,随后逐渐下降;在蛹及成虫阶段lncR-26319呈现先上升后下降趋势,两个miRNA呈现先下降后上升的趋势,表明这些lncRNA可能通过miRNA参与家蚕变态发育。2.lncRNA与miRNA在家蚕不同组织中的表达谱。两个lncRNA和两个miRNA的趋势相同,在家蚕的大脑、精巢和中肠中表达量比较高,在马氏管、丝腺、血淋巴和脂肪中表达量较低。大脑、精巢和中肠是功能和结果比较复杂的组织,lncRNA和miRNA在其中可能扮演着重要的角色。3.lncR-26319、miR-2834与靶基因endophilin A在家蚕蛹期表达谱。通过生物信息学预测的靶标基因,结果发现家蚕内吞蛋白endophilin A的3’-UTR与miR-2834的种子序列匹配较好,可能是miR-2834的真实靶标。endophilin A是内吞蛋白,在家蚕变态发育过程中具有重要的作用,endophilin A基因突变会导致细胞自噬不能正常发生,自噬是家蚕化蛹过程中的必经步骤,自噬功能的缺失将导致家蚕变态发育异常。为进一步验证二者是否存在真实的互作关系,我们在家蚕蛹期检测lncR-26319、miR-2834和靶标基因endophilin A的表达谱。结果显示,lncR-26319和miR-2834表达趋势相反,和靶标基因endophilin A表达趋势一致,均呈现发育前期低后期高的趋势,表明lncR-26319可能作为miR-2834海绵抑制miRNA的表达。4.体外实验验证miRNA和靶标基因的互作关系。我们首先构建endophilin A3’-UTR的过表达载体psiCHECK-endophilin A。其次,在HEK293细胞系中共转染miR-2834 mimics和psiCHECK-endophilin A,通过双荧光素酶报告基因系统检测miR-2834和endophilin A的互作关系。结果表明,miR-2834过表达可以造成靶标基因psiCHECK-endophilin A的荧光素酶活性降低40%以上,差异极显著,表明endophilin A是miR-2834的真实靶标。本研究首次发现miR-2834可以靶向修饰自噬相关蛋白endophilin A,表明miR-2834可能在家蚕变态发育过程中发挥重要作用。该研究结果为利用miRNA及lncRNA参与家蚕变态发育提供了良好的前期基础,为家蚕的转基因改良提供了理论依据。