随着肿瘤生物学以及免疫学知识的发展,肿瘤免疫治疗引起了人们的强烈关注。多肽疫苗作为免疫疗法的一种,制备简单,储存方便,使用安全,成为免疫疗法治疗肿瘤的热点,近年来得到了广泛的应用。但是,简单抗原多肽构建的疫苗只能诱导较弱的免疫应答。单个多肽疫苗只有一个抗原表位,免疫应答谱系窄,易导致免疫逃逸。使用混合多肽增加抗原表位数量,拓宽应答谱系,有望克服肿瘤的免疫逃逸,实现肿瘤高效治疗。抗肿瘤免疫应答起始于抗原提呈细胞(APC)摄取抗原和提呈抗原。树突状细胞(DC)具有强大的激活初始T细胞的能力,是功能最强的专职抗原提呈细胞,为适应性免疫应答的启动者。提高DC对抗原的摄取,联合使用模式识别受体激动剂是增强抗原免疫原性、打破免疫耐受的常用方法。但这些方法常常被多种药物共输送的难题所阻碍。纳米递送系统则能满足多种抗原与免疫佐剂共递送的要求。本文针对高侵袭性、高度异质性的黑色素瘤,设计一种混合多肽(hgp100, KVPRNQDWLC; p15E, KSPWFTTLC; TRP2, SVYDFFVWLC)与免疫佐剂(单磷酰糖脂A, MPLA)共载的纳米粒,来增强抗肿瘤免疫应答。通过下述4个步骤构建纳米粒：(1)将多肽与聚乳酸(PLA)-聚乙醇酸(PGA)的共聚物PLGA化学偶联,减少不同种多肽间的理化性质差异；(2)将合成的PLGA-peptides聚合物应用纳米沉淀法制备纳米粒；(3)所得纳米粒与红细胞膜(RBCm)共挤压制备RBCm包被的纳米粒；(4)制备的纳米粒与MPLA共超声装载免疫佐剂。合成的聚合物-多肽偶联物经核磁共振氢谱(1H-NMR)确证其结构,在二硫苏糖醇(DTT)条件下确定其还原响应性,证明该材料符合设计要求,还原响应性良好,并能迅速释放多肽。在此基础上,我们通过纳米沉淀法制备纳米粒,所得纳米粒为130-150nm的球形颗粒,其RBCm包被核壳结构由透射电子显微镜(TEM)确证,壳层厚度大约10nm。由于涉及多种多肽共包封,纳米粒制备过程中存在较多问题需要克服,按精确比例载入免疫原性物质是多组分共载纳米疫苗存在的重大困难之一,本文从聚合物分子量大小及单一多肽产率方面对纳米递送系统进行优化。经过测定,不同混合多肽给药组均可达到等比例混合共载的要求(两种多肽共载比例为1：1,三种多肽为1：1：1,wt)。解决了多肽的包封问题以后,我们以包载了hgpl00的纳米粒为模型,检测了纳米粒的释放行为。通过体外模拟细胞内环境,验证了纳米粒还原敏感性释放的特性,结果表明多肽在细胞内高还原型谷胱甘肽的条件下快速释放,而在体液环境低还原性条件下几乎不释放。按设计要求释放的纳米粒可用于下一步实验,我们使用制备的纳米疫苗注射小鼠,观察毒性反应。经检测,小鼠注射纳米疫苗后没有发生不良反应,抗红细胞抗体滴度、ALT、AST和BUN等指标都与对照组没有显著性差异,表明安全性良好,满足给药要求。在满足安全性要求以后,我们通过体外和体内实验来确证纳米疫苗对DC熟化作用的影响。根据实验结果,我们设计的纳米疫苗体外、体内均能刺激DC熟化,但是不同多肽联用熟化DC的能力有差别,以hgp100和TRP2联用效果最佳。在初步验证了纳米疫苗能够激发体内的免疫应答后,我们通过小鼠黑色素瘤模型来评价它的治疗效果。在预防实验与治疗实验中,hgp100与TRP2联用抗肿瘤效果最好,实验结果符合DC熟化程度的趋势。肺转移实验p15E与TRP2联用结节数最少,但是与HT-NP相比没有显著性差异,HT-NP仍然抑制肿瘤发生较好的组别。在三个药效学评价实验中,三种多肽联用都没有表现出最好结果。为了解释这些现象,我们首先分析了三种多肽在黑色素瘤发生过程中作用。虽然这三种多肽同为肿瘤相关抗原肽,但它们来自不同的蛋白分子。这些蛋白分子在细胞内执行的功能不同,hgp00是胚胎早期出现的分化抗原,在黑色素瘤发生过程中过度表达,属于黑色素肿瘤相关抗原H-2Db限制性表位。p15E是致癌逆转录病毒壳蛋白抗原表位,属于H-2Kb限制性表位。酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2, TRP2)是在正常黑色素细胞中表达,但是在黑色素瘤中过度表达的蛋白,属于H-2Db限制性表位。之后,我们探讨了纳米疫苗的作用机制。通过检测发现,hgp100和TRP2联用刺激CTL增值和IFN-γ分泌的能力最强,实验结果能够解释药效学研究的结果。综上所述,本文构建了混合多肽与免疫佐剂共载的聚合物纳米疫苗。实验结果证明,不同种类多肽联用将产生不同治疗效果。这种现象可归因于免疫应答背后复杂的调控机制,一个抗原表位在诱导免疫应答的同时,也会触发了负向调节机制,以保护机体免受损伤。研究纳米疫苗的作用机制不仅可以解释其作用方式的问题,而且为如何选择有效抗原提供了理论支持。随着多肽疫苗的发展,越来越多的肿瘤相关抗原肽被识别。作为一个验证多肽有效性的实验平台,它不仅适合于现有多肽联合应用的筛选,而且同样适用于新抗原联合应用的研究。本文的实验结果对如何选取抗原提供了新思路。