研究背景和目的： 姐妹染色单体的分离是由分离酶(separase)水解粘合素(cohesin/SCC1)后发生。姐妹染色单体的分离是一精确时空调控事件，分离的紊乱会造成遗传物质传递的不稳定性，导致细胞的非整倍性(aneuploidy)，从而引起细胞或个体的死亡或病态。现在普遍认同一种保守的机制参与姐妹染色单体的分离：随着姐妹染色单体复制的完成，姐妹单体之间也随之建立由cohesion维持的结合]。有丝分裂后期，体内后期促进复合物(APC/C)泛素化降解保全素(securin)，从而促使激活的separase裂解cohesion，引发姐妹染色单体的分离。随着研究的深入，人们对separase在真核细胞姐妹染色单体分离中的机制有了进一步认识：脊椎动物cohesin的解离分两步：第一步发生在前期和前中期，主要裂解大部分染色体臂上的cohesin，此过程主要涉及Pole-likekinase(P1k1)和Aurora-B，尤其P1k1对Scc3和SA2亚基的磷酸化是cohesin在分裂前期和前中期裂解所必需的；第二步在后期，中心粒区域的cohesin通过securin-separase通路而降解。着丝粒处的cohesin没有被前期裂解途径降解的原因在于shugoshins对其的保护。 Separase表达异常影响细胞基因组不稳定性、肿瘤形成敏感性。Waizenegger等的研究显示，人类细胞通过RNAi抑制：Esp1表达后，形成了含有大叶状核的多倍体细胞，在这些细胞有丝分裂过程中，许多细胞都含有不分离的姐妹染色单体。KarinG.Wirth等发现小鼠separase等位基因条件敲除能够阻止染色体的分离，但是无法阻止有丝分裂的其他特征，如胞质分离，染色体的复制等。JenniferL.Shepard等通过诱变剂N-甲基N-硝基N-亚硝基-胍作用于separase基因突变的斑马鱼，结果所有肿瘤的发生率增加0.25倍，而上皮性肿瘤发生率增加0.8倍。 Separase能促进细胞凋亡的发生。Uhlmann等指出Esp1(separase)功能类似caspases，二者同属于半胱氨酸蛋白酶，二者在C端含有保守的半胱氨酸残基，该残基正是Caspases的催化活性基团⒁。Pati和Chen在2002年分别提出：cohesion/Rad21亚基的裂解会引起细胞凋亡。2005年AtienzaJM进一步报道：对Rad21进行RNA干扰，减少Rad21mRNA的表达后发现肿瘤细胞增殖受到抑制，凋亡增加。HuiYang等研究发现，在过氧化氢诱导下，酵母细胞中类似caspases的separase通过切割类似Rad21的Mcd1诱导凋亡。 separase在细胞遗传物质的传递、基因组不稳定性、肿瘤敏感性及凋亡中的重要作用引起我们极大关注。但是目前国内、外的研究集中在正常真核细胞separase功能方面，而关于separase在肿瘤细胞中的作用还没有文献报道。既然有研究发现分离酶低表达或不表达可以增加肿瘤易感性，我们就假设如果让本来separase低表达的肿瘤细胞高表达，那么其生物学性状会不会发生改变呢?我们选择Hela细胞作为研究的细胞株，主要是其异常染色体均数多达85条，和正常宫颈上皮细胞染色体46条差别明显，有利于观察染色体改变。随着研究的进展，我们证实了上调表达的separase可以在一定程度上逆转肿瘤细胞的恶性程度，那么这种现象是否和separase上调表达肿瘤细胞的凋亡改变有关呢?本研究就Hela细胞(肿瘤细胞)中separase上调表达后对生物学性状影响做初步的研究。 方法和结果： 1.Tet-on系统表达调控模型的建立： 质粒PSK-Esp1用EcoRⅠ，SacⅡ双酶切，胶回收目的片段Esp，定向克隆插入pTRE-d2EGFP，转入大肠杆菌后挑出正确的重组子，采用XhoⅠ，SphⅠ双酶切鉴定插入方向，测序鉴定其序列的正确性，成功构建Esp1-pTRE-d2EGFP表达载体。利用FuGENE 6脂质体转染PTet-on质粒，转染24h后加G418(200ng/ml)，筛选2周后挑选单个细胞克隆扩大培养。将Esp1-pTRE-d2EGFP质粒与PTK-Hyg质粒按摩尔比为20:1转染已经成功转染PTet-on质粒的Hela细胞中，转染24h后加G418(600μg/ml)，潮霉素(200μg/ml)，筛选2周后挑选单个细胞克隆扩大培养。用FQ-PCR、WB分别在mRNA和蛋白水平上检测目的基因Esp1的表达水平，结果发现强力霉素(DOX)的最适诱导浓度为200ng/ml，Esp1mRNA从0.293增加至5.162(Esp1/GAPDH)，蛋白表达转染后明显增加。 2.Esp1上调表达对Hela细胞倍性的影响： 收集最适浓度200ng/mlDOX诱导下的Hela细胞，采用秋水仙素法制备染色体，然后人工光学显微镜下计数染色体，同时利用染色体工作分析站自动分析计数染色体。采用荧光染色细胞仪分析Hela细胞DNA含量、倍性及细胞周期变化。结果发现：Esp1上调表达后，Hela细胞染色体均数从83条降到71条；Hela细胞倍性DI(DNAindex)从2.20降到1.89。 3.Esp1上调表达对Hela细胞凋亡的影响： 保持最适浓度200ng/mlDOX压力下，分别选择药物Etoposide(VP-16)和X-ray诱导Hela细胞凋亡，采甩FITC-AnnexinV凋亡试剂盒处理，流式细胞仪上机检测凋亡。结果发现在VP-16诱导下，Hela细胞凋亡率从转染前的2.3％增加到转染后的19.4％；在X-ray诱导下，凋亡率从转染前的3.8％增加到转染后的14.8％。 结论： 1.通过建立Tet-on系统表达调控模型，我们发现：随着DOX浓度的增加，目的基因Esp1的表达同步增加，但是低于或者高于DOX有效浓度，Esp1的表达变化不明显。该系统的建立，有助于我们观察目的基因Esp1从低浓度到高浓度表达对Hela细胞生物学性状的影响，可以使我们能够在定量的水平上调控分离酶的表达，为研究基因功能、疾病基因治疗打下基础。 2.Esp1基因过表达后，观察到Hela细胞染色体数减少，FACS证实DNA倍性降低。有文献报道，separase和cohensin的亚单位Rad21一起能够修复损伤的DNA及促进染色体的正确分离。结合我们的发现，提示高表达separase在促进分裂中期姐妹染色单体的分离中发挥一定的作用，在一定程度上可以逆转Hela细胞的恶性程度。 3.Esp1基因过表达，X-ray和VP-16诱导下可以使Hela细胞的凋亡率增加。说明在两种不同的凋亡通路诱导作用下都可以使凋亡增加，那么分离酶在凋亡通路中发挥作用的位点必定不在X-ray和VP-16诱导凋亡通路交叉点的前面而是在其后面。目前我们还不清楚高表达的separase在使肿瘤细胞凋亡率增加和减少染色体数目、降低DNA倍性在抑制肿瘤细胞恶性程度上发挥作用是平行关系还是促进关系。 本实验构建了可调控、诱导表达、无多效性和低背景表达等优点的Tet-on系统表达调控模型，并动态观察了随Esp1基因表达的线性增加，Hela细胞生物学性状的改变，说明高表达的separase能一定程度上抑制Hela细胞的染色体的数目，在X-ray和VP-16诱导下上调表达的separase增加Hela细胞的凋亡。下一步，我们将通过动物体内实验，观察不同浓度DOX诱导Tet-on系统Esp1基因表达改变对体内肿瘤细胞的生物学性状的影响，进一步探讨分离酶在致瘤和肿瘤转归中的作用机制。