研究背景:脑梗死是威胁人类身心健康的主要疾病之一。随着神经影像诊断技术在新生儿领域的广泛应用,新生儿脑梗死(Neonatal cerebral infarction,NCI)的发病率和诊断率逐渐增高。据统计,新生儿缺血性脑梗死的发病率约为1/2300～4000。多种新生儿疾病均可引起脑梗死,如新生儿缺氧缺血性脑病、中枢神经系统感染、红细胞增多症、脑血管发育畸形等。脑梗后可遗留脑瘫、癫痫、认知障碍、视听功能障碍等,严重影响远期预后,给家庭和社会造成巨大负担。治疗方面,由于新生儿神经系统独特的生理病理特点,许多成熟应用于成人或儿童的治疗方法,如组织纤溶酶原激活剂(t-PA)溶栓治疗,在新生儿中应用的安全性和有效性尚不明确。迄今为止,新生儿脑梗死仍以对症治疗为主,缺乏有效的对因治疗手段。大量研究证实,神经干细胞移植具有巨大的治疗潜力。多年来,尽管在了解缺血性脑梗死的潜在机制方面付出了巨大努力,但这在很大程度上仍是未知的。在过去的四十年里,各种各样的动物脑梗模型已经被开发出来,目的是明确发生脑缺血的机制和开发新的治疗药物。在哺乳动物中,神经干细胞主要分布在腹侧区(VZ)、室下区(SVZ)、纹状体、齿状回、脊髓等部位。其中,SVZ是产生新神经元的主要区域。大量的研究采用腔内缝合MCAO(middle cerebral artery occlusion)模型的SVZ来探讨缺血性脑梗死的潜在机制和治疗方法。大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)及其分支是缺血性脑梗死最常见的脑血管,约占梗死体积的70%。闭塞该动脉最接近人类缺血性脑梗死的表现。MCAO模型有几个优点:首先,创伤小,不需要开颅手术,因此相对容易执行,且不耗时;并且具有梗死体积大、重复性高的特点;此外,再灌注和缺血时间是可以精确控制的。MCAO模型被认为适合于复制缺血性脑梗死及随后的神经元死亡、脑炎症和血脑屏障(BBB)损伤,并在行为测试中产生良好的结果。因此,我们选择利用MCAO方法制作大鼠缺血性脑梗死模型,并检测各项生理指标,以确定建模是否成功,进而利用该模型探讨缺血性脑梗死的分子机制。TAOKs(Thousand and one kinases)是重要的生发中心激酶(Ste20p)类亚家族成员之一,由TAOK1、TAOK2和TAOK3组成。Ste20p家族含有多种蛋白质激酶,其中一些己经被证明作用于MAPKs的上游。TAOKs激活MAPK信号通路。TAOK1和TAOK2也通过激活JNK-MAPK和caspases诱导凋亡形态学改变。其他研究表明TAOK1通过激活微管亲和调节激酶(MAR/PAR-1)和微管相关蛋白tau的磷酸化诱导微管不稳定性,TAOKs在有丝分裂过程中被磷酸化和特异性激活。此外,TAOK1参与P38和c-Jun NH2末端激酶(JNK)对DNA损伤和应激刺激的激活。TAOK1还可通过直接磷酸化T195来抑制细胞增殖,从而调节Hippo信号通路在发育中的作用。另有研究发现TAOK1在IL-17介导的信号和炎症中起负调节作用。TAOK1抑制IL-17诱导的炎性细胞因子和趋化因子的表达。TAOK1抑制HeLa细胞中IL-17激活的p38、JNK、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和p65。TAOK1与IL-17RA相互作用,以激酶活性无关的方式抑制IL-17RA-Actl复合物的形成,导致IL-17介导的炎症反应的负调控。然而,TAOK1是否在缺血性脑梗死的神经细胞凋亡和炎症反应中起作用还尚不清楚。研究方法:采用大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)建立缺血性脑梗死动物模型;用氧葡萄糖联合剥夺技术(OGD)处理大鼠皮层神经干细胞建立缺血性脑梗死细胞模型;采用Bederson和Zea-Longa神经功能缺损评分及转轮试验对模型动物进行验证;用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测TAOK1在体内外模型中的表达;通过过表达TAOK1或shRNA干扰TAOK1的表达检测TAOK1在缺血性脑梗死体内和体外模型中对细胞增殖(CCK-8),凋亡(TUNEL染色,AnnexinV及Hoechst33342染色)及炎症因子(IL-lβ,IL-6和IL-8)表达的作用;检测PI3K/AKT和MAPK信号通路在TAOK1介导的神经干细胞增殖,凋亡和炎症因子表达中的作用。研究结果:我们利用SD大鼠制作了 MCAO模型以模拟缺血性脑梗死。在造模后的24小时进行Bederson/Longa评分对MCAO模型组及假手术组大鼠分别进行评估。MCAO模型组Bederson评分为3分,与假手术组有显著性差异(P<O.001);Longa评分为3.5分,同样与假手术组有显著性差异(P<0.001)。TTC染色结果显示,MCAO大鼠同侧大脑半球有很大比例的广泛梗死区。在转轮实验中,与假手术组相比,大鼠在平均速度、掉落时间、步行距离和旋转速度方面均表现出明显的运动行为学缺陷(P<0.001)。这些结果提示,我们成功地建立了大鼠缺血性脑梗死模型,并使其出现运动功能障碍。采用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测TAOK1在SVZ中的表达。qRT-PCR结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ中TAOK1的mRNA表达显著降低(P<0.01)。Western blot结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ中TAOK1的蛋白表达显著下调。免疫荧光染色结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ中TAOK1的染色强度明显减弱。此外,我们还通过免疫荧光染色确定了 TAOK1和神经干细胞在脑切片中的分布。我们发现TAOK1和Nestin在MCAO大鼠全脑切片和SVZ中均广泛分布。采用TUNEL法检测MCAO组和假手术组大鼠SVZ脑片的神经干细胞凋亡。结果显示,与假手术组相比,MCAO组大鼠SVZ脑片的凋亡率显著增加。此外,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-8的表达,结果表明,与假手术组大鼠相比,MCAO组大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平显著升高(P<0.01)。采用胎鼠18日龄皮层神经干细胞建立缺血性脑梗死细胞模型。用免疫荧光法检测Nestin、GFAP和Tuj1的染色情况,以证实神经干细胞的纯度,结果显示明显的Nestin阳性信号和GFAP/Tuj1阴性信号,表明培养物中大多数细胞是神经干细胞。然后,我们检测了经OGD处理后神经干细胞中TAOK1的表达。结果表明,与正常神经干细胞相比,经OGD处理的神经干细胞中TAOK1的mRNA和蛋白表达显著降低(与正常组相比,P<0.001)。此外,免疫荧光显示与正常组相比,经OGD处理的神经干细胞中TAOK1的免疫荧光染色显示出明显的减弱信号。为探讨TAOK1对OGD诱导的体外缺血性脑梗死细胞模型的影响,采用shRNA或TAOK1重组质粒在OGD诱导的神经干细胞中敲除或过度表达TAOK1。与正常组相比,OGD组细胞增殖明显受到抑制(P<0.001);与OGD+NC组相比,TAOK1的敲除(OGD+shRNA)加重了 OGD诱导的细胞增殖抑制作用,而TAOK1的过表达(OGD+TAOK1重组质粒)部分逆转了 OGD诱导的细胞增殖抑制作用(P<0.001)。在细胞周期分析中,与正常组相比,OGD组的细胞数在G0/G1期显著上调,在S期显著下调。OGD+shRNA组细胞数在G0/G1期显著上调,S期显著下调,而OGD+TAOK1组与OGD+shRNA组相比呈相反趋势。TUNEL分析显示,OGD组的细胞凋亡率明显高于正常组,与OGD+NC组相比,OGD+shRNA组细胞凋亡明显加重,而OGD+TAOK1重组质粒组细胞凋亡率明显减轻。此外,Western blot检测凋亡相关蛋白和细胞周期相关蛋白,结果显示与正常组相比,OGD组Bax、剪切型caspase-3和p-21表达显著上调,而Bcl-2和CyclinD1表达显著下调。与OGD+NC组相比,OGD+shRNA组Bax、裂解caspase-3和p-21的表达较高,而OGD+TAOK1重组质粒组表达较低;OGD+shRNA组和OGD+TAOK1重组质粒组Bcl-2和CyclinD1的表达与Bax、裂解caspase-3和p-21的表达呈相反趋势。进一步研究发现TAOK1的内源性激酶活性决定了 TAOK1对OGD诱导的细胞凋亡的影响。Western blot结果显示,在OGD诱导的皮层神经干细胞中,TAOK1的过表达介导了 Bcl-2的显著上调、Bax和剪切型caspase-3的显著下调,而在内源性激酶失活后这种作用明显减弱。此外,TUNEL结果显示,内源性激酶失活可阻碍TAOK1过表达介导的凋亡减少。ELISA检测IL-1β、IL-6和IL-8的产生。与正常组相比,OGD处理显著增加了 IL-1β、IL-6 和 IL-8 的产生(P<0.01)。与 OGD+NC 组相比,OGD+shRNA组的IL-1β、IL-6和IL-8表达显著增加,而OGD+TAOK1组的IL-1β、IL-6和IL-8表达显著降低(P<0.05)。OGD组p-AKT和PI3K表达较正常组明显降低。而OGD组p-ERK和p-P38的表达与p-AKT和PI3K呈相反的表达趋势。与OGD+NC组相比,OGD+shRNA组p-AKT和PI3K表达较低,而OGD+TAOK1组表达较高。然而,p-ERK和p-P38的表达在OGD+shRNA组较高,而在OGD+TAOK1组较低,说明PI3K/AKT和MAPK信号通路参与TAOK1在缺血性脑梗死中的调节作用。结论:我们的研究结果显示在体内外脑缺血缺氧模型中,TAOK1表达明显下调,而细胞凋亡及IL-1β、IL-6和IL-8的表达均上调。在体外细胞模型中,TAOK1部分逆转了 OGD诱导的细胞凋亡和IL-1β、IL-6和IL-8表达的上调。在机制上,PI3K/AKT和MAPK信号通路参与了 TAOK1对缺血缺氧后细胞凋亡及炎症反应的影响。