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研究目的：1.临床部分纳入Ⅲb-Ⅳ期、肝郁脾虚型原发性肝癌患者,治疗组采用新健脾理气方联合体外高频热疗,对照组采用单纯新健脾理气方,观察新健脾理气方联合热疗治疗晚期肝癌的临床疗效,探讨其在晚期原发性肝癌综合治疗中的作用,从而为临床治疗晚期肝癌提供新的治疗方案。2.实验部分采用人肝癌细胞株HepG2进行体外实验,探讨：①新健脾理气方联合热疗治疗肝癌的作用及机制；②新健脾理气方联合热疗是否能达到协同增效的效果。研究方法：1.临床部分根据纳入标准选入41例肝功能Child-Pugh A或B级、Ⅲb-Ⅳ期(AJCC分期)、肝郁脾虚型原发性肝癌患者,分成治疗组和对照组。治疗组采用新健脾理气方联合体外高频热疗(新健脾理气方250ml bid po, d1-30;体外高频热疗采用珠海和佳公司生产的HG-2000型体外高频热疗机(电磁波频率为13.56MHZ),设置温度为42.5℃-43℃,每次60min,每周至少3次)。对照组单纯口服新健脾理气方治疗。30天为1周期,治疗连续3周期。在首3个月治疗,每月复查一次,之后每2个月复查一次,以评估两组的疾病控制率(DCR=CR+PR+SD)、疾病进展时间(TTP)、总体生存时间(OS)、毒副反应。所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,患者的基本特征、近期疗效、毒副反应评价采用描述性统计,TTP、OS采用Kaplan-Meier分析；临床特征的组间比较采用方差分析和Pearsorn χ2检验；近期疗效比较采用两个独立样本Mann-Whitney U Test。双侧检验P<0.05为差异有统计学意义。2.实验部分选取人肝癌细胞株HepG2作为研究对象,细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEMH培养基中,细胞传代24h进入对数生长期后进行各种干预措施。新健脾理气方组加入0.25mg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml浓度新健脾理气方溶液的完全培养基200ul；热疗组细胞置于43.0℃恒温循环水浴箱中孵育1小时；新健脾理气方+热疗组加入上述各浓度新健脾理气方溶液的完全培养基后,再放置于43℃恒温水浴箱中孵育1小时；对照1组加入等体积完全培养基,对照2组加入与2mg/ml新健脾理气方溶液等体积PBS的完全培养基,空白组加入不含细胞、与对照组等体积的培养基。处理后的各组细胞放置于37℃,5%CO2培养箱中继续培养,分别于24、48、72小时按实验要求进行。MTT法测定新健脾理气方联合热疗对肝癌细胞增殖的抑制作用；荧光倒置显微镜下观察新健脾理气方联合热疗作用后的人肝癌细胞株HepG2的形态学变化；流式细胞仪检测新健脾理气方联合热疗对人肝癌细胞株HepG2的细胞凋亡的影响；Western Blotting法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。研究结果：1.临床部分(1)临床特征患者于2010年9月至2012年12月纳入研究。治疗前两组基线资料,性别、年龄、分期、体力状态评分、肝功能分级、肝炎状态等均无显著性差异,组间分布均衡(P>0.05)。对照组1例因未遵循治疗方案而出组。实际可评估疗效病例40例,已死亡31例,其余9例正在随访中,41例患者的临床特征见表1-1。其中95%为男性患者,年龄32-79岁,中位年龄60岁。体力状态为1分、2分的患者分别为19例(46.3%)、15例(37.5%),3分的患者有7例(17.1%)。乙型肝炎背景的患者33例(80.5%),丙型肝炎患者3例(7.3%)。肝功能Child-Pugh分级中以A级患者为多,共29例(70.7%),B级的有12例(29.3%)。所有患者在入组时均属晚期肝癌,其中分期为Ⅲb/Ⅲc期和Ⅳ期的患者分别为20例(48.8%)和21例(51.2%)。(2)中位疾病进展时间治疗组和对照组中位疾病进展时间(mTTP)分别为4.5个月和3.1个月,治疗组的mTTP延长了1.4个月,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(3)中位总体生存时间治疗组和对照组中位总生存时间(mOS)分别为6.6个月和5.5个月,治疗组的mOS延长了1.1个月,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(4)疾病控制率治疗组和对照组的疾病控制率(DCR=CR+PR+SD)分别为25%和15%,治疗组的DCR略高于对照组,但两组比较差异无统计学意义。(5)毒副反应治疗组和对照组治疗前后血常规、肝肾功能、心电图检查均无明显变化,无明显血液学毒性反应,无呕吐、腹泻等胃肠道毒性反应,无过敏、脱发及皮肤毒性反应。2.实验部分(1)MTT法检测新健脾理气方联合热疗对人肝癌细胞株HepG2增殖的研究新健脾理气方及新健脾理气方联合热疗作用不同时间对人肝癌细胞株HepG2增殖均有抑制作用,且随药物浓度的增大和作用时间的延长而增强,呈一定的时间和剂量依赖关系。经热疗处理后不同时间对人肝癌细胞株HepG2均有一定程度的抑制,增殖抑制率随作用时间的延长而增强,呈一定的时间依赖关系,其中以热疗后72h对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制率为最高。新健脾理气方与热疗联合应用后的增殖抑制率高于单独应用热疗及单独应用新健脾理气方的增殖抑制率,具有协同效应,且以二者联合应用作用24h后对人肝癌细胞株HepG2抑制的协同效应最强。(2)荧光显微镜及流式细胞仪检测新健脾理气方联合热疗对人肝癌细胞株HepG2凋亡的研究新健脾理气方、热疗及新健脾理气方联合热疗作用于人肝癌细胞株HepG224h后,荧光显微镜下可观察到肝癌细胞出现凋亡相关的形态学改变。新健脾理气方联合热疗作用于人肝癌细胞株HepG2后,其细胞的凋亡形态学改变更为明显。新健脾理气方、热疗作用于人肝癌细胞株HepG224h后,肝癌细胞的早期凋亡率均有升高,具有一定的剂量依赖性。新健脾理气方联合热疗的凋亡率升高,二者联合应用的促凋亡作用增强。(3)Western Blotting检测新健脾理气方联合热疗对人肝癌细胞株HepG2Bax. Bcl-2蛋白表达的研究新健脾理气方、热疗及新健脾理气方联合热疗作用24h后出现Bax蛋白表达增强、Bcl-2蛋白表达减弱和Bax/Bcl-2升高,其中以终浓度为0.5mg/ml的新健脾理气方联合热疗时Bax/Bcl-2升高最为明显。选定终浓度为0.5mg/ml的新健脾理气方、热疗及二者联合作用不同时间,亦出现Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱及Bax/Bcl-2升高。二者联合作用24h的Bax蛋白表达增强最为明显,作用48h的Bcl-2蛋白表达减弱最明显,作用48h的Bax/Bcl-2升高最明显。研究结论：1.临床部分本研究通过前瞻性随机对照试验,新健脾理气方联合体外高频热疗可有效延长总生存时间和疾病进展时间,且较单纯新健脾理气方中药治疗效果好,为不能接受手术、介入及靶向药物治疗的晚期原发性患者提供了新的中西医结合治疗方案。2.实验部分(1)新健脾理气方与热疗单独及联合应用对人肝癌细胞株HepG2均具有抑制增殖的作用,二者联合应用的增殖抑制率升高,具有协同效应。(2)新健脾理气方与热疗单独及联合应用对人肝癌细胞株HepG2均具有诱导细胞凋亡的作用,二者联合应用的促凋亡作用增强。(3)新健脾理气方与热疗单独及联合应用均上调人肝癌细胞株HepG2Bax蛋白表达水平,下调Bcl-2蛋白表达水平,二者联合应用时Bax蛋白表达增强更明显,Bcl-2蛋白表达减弱更明显。