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土地盐渍化影响到农业的发展,提高植物耐盐性已成为开发利用盐碱地的主要手段。四倍体刺槐(Robinia pseudoacacia)是我国从韩国引进的刺槐新品种,是优良的生态树种和饲料树种,通过遗传转化提高四倍体刺槐的耐盐性,对于扩大其栽培面积、改善生态环境和发展畜牧业将具有重要的作用。
甜菜碱是重要的有机渗透调节物质之一,能够增加胞质渗透压,平衡液泡水势,还对膜系统和蛋白质等生物大分子有一定的保护作用。胆碱脱氢酶基因(betA)和甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)为甜菜碱合成途径中的两个关键酶基因,分别调控甜菜碱合成的两步反应,将它们导入植物将有助于耐盐性的提高。因此,我们开展了耐盐基因betA和BADH的亚克隆、植物表达载体构建和以四倍体刺槐为受体的农杆菌介导遗传转化研究,取得如下结果:
1、分别从pCPA-betA和pC2300-BADH亚克隆了betA、BADH基因cDNA,将pCPA-betA上的betA编码序列上游SacⅠ更换为SmaⅠ,便于插入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体及构建双价基因植物表达载体。
2、构建了betA单价基因和betA/BADH双价基因耐盐抗旱基因植物表达载体。单价基因载体pCAMBIA2300-betA含有“CaMV35S启动子-betA基因-终止子”表达单元及一个CaMV35S启动子驱动的NPTⅡ筛选基因;双价植物表达载体pCAMBIA2300-betA-BADH含有“CaMV35S启动子-betA基因.终止子-CaMV35S启动子-BADH基因-终止子”表达单元及CaMV35S启动子驱动的NPTⅡ筛选基因。通过酶切鉴定及测序,证明构建的植物表达载体符合设计目标。
3、对农杆菌介导的刺槐遗传转化体系进行了优化。结果表明,以四倍体刺槐组培苗茎段为外植体,用平板培养法活化农杆菌,用200μmol/L的乙酰丁香酮(As)溶液处理伤口可提高再生抗性芽获得率,低温预培养处理后可在短期内(30 d)使再生抗性芽获得率和生长状态均有所提高。
4、采用农杆菌介导法转化四倍体刺槐,获得了转betA单价基因及betA-BADH双价基因的再生植株; PCR检测初步证明,已分别获得了betA基因及betA-BADH双价基因的四倍体刺槐转基因株系。