【摘 要】
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抗体功能化微纳材料因其亲和力和特异性的优势被广泛应用于临床诊断、生物分离纯化和环境与食品检测等领域,其中材料表面抗体分子状态(密度、取向等)的调控、非特异性吸附是开发抗体功能化材料的关键科学问题。本文制备了一系列不同电性高分子刷修饰的纳米粒子,通过物理吸附固定抗HCG抗体。考察了抗体种类、电荷密度、溶液离子强度、p H和复杂生化液体等多种因素对抗体固定及其抗原结合活性影响;选择最佳孵育条件用于竞争
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抗体功能化微纳材料因其亲和力和特异性的优势被广泛应用于临床诊断、生物分离纯化和环境与食品检测等领域,其中材料表面抗体分子状态(密度、取向等)的调控、非特异性吸附是开发抗体功能化材料的关键科学问题。本文制备了一系列不同电性高分子刷修饰的纳米粒子,通过物理吸附固定抗HCG抗体。考察了抗体种类、电荷密度、溶液离子强度、p H和复杂生化液体等多种因素对抗体固定及其抗原结合活性影响;选择最佳孵育条件用于竞争性ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)。此外还探索了利用高灵敏数字ELISA检测白介素-17A(IL-17A)的实验条件。首先,选取了十种单体(正电性、负电性和两性),采用原子转移自由基聚合(ATRP)在纳米粒子表面生长高分子刷,制备了一系列不同电性和电荷密度的纳米粒子。正电荷密度变化范围为26.9±1.2 m V(Si-pDEAEMA)至43.7±1.6 m V(Si-pAGE),负电荷密度变化范围-20.9±2.4 m V(Si-pMA)至-40.4±1.8 m V(Si-pHEMA)。其次,通过物理吸附在不同电性和电荷密度的纳米粒子表面固定抗体。实验表明抗体在正电荷纳米粒子表面倾向于Fab朝外,随纳米粒子正电荷密度升高抗体固定量减少,抗原结合强度先增大后减小;在负电荷纳米粒子表面抗体取向随负电荷密度的增高逐渐趋向于Fc片段朝外,两种抗体固定量均逐渐增加,抗原结合强度先减小后增大。比较纳米粒子的Kd值,抗体选择抗α-HCG抗体,材料选择Si-pDMAEA与Si-pMA依次考察p H、离子强度与纳米粒子粒径对抗原结合强度的影响。在pH 6.1,溶液离子强度为0.05%条件下,Si-pDMAEA(24 h)与Si-pMA(24 h)条件下,抗原结合强度最强。将最优条件用于竞争性ELISA,两种材料检测下限为5.83 m IU/m L(Si-pDMAEA)与6.45m IU/m(Si-pMA)。人工尿液孵育后,抗体固定量减少,抗原结合强度降低。最后,研究了高灵敏数字ELISA检测白介素-17A的多种条件。考察了铁磁性微球免疫复合物形成的条件,包括孵育方法、检测抗体与链霉亲和素-β-半乳糖苷酶偶联物浓度、孵育时间,并对检测的重现性做出评价。通过比较R2、C计算/C实际和变异系数(CV值)来确定最佳孵育条件:免疫复合物两步法孵育、检测抗体浓度为0.3μg/m L、SβG浓度为40 p M、孵育为2 h。IL-17A样品重复实验5次,CV值变化范围在1.98-9.78%,具有较好的重现性。检测下限(LOD)为0.1 pg/m L,对标市售的IL-17A ELISA试剂盒降低了180倍。
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