论文部分内容阅读
研究背景和目的:骨骼肌的再生是修复骨骼肌损伤的关键。随着年龄的增长,骨骼肌再生能力明显下降,而骨骼肌再生的关键——低氧通路,其活性也受到抑制。目前科学界对于低氧通路导致骨骼肌再生能力下降的机制仍然缺乏完整的认识。有研究表明芳香烃受体核转运子(ARNT)是低氧通路中的关键组成部分,可能是调控骨骼肌再生的关键。本研究旨在探索骨骼肌再生机制,为提高老龄人口骨骼肌再生效率,寻找促骨骼肌再生方法提供理论依据。方法:1.分析衰老对骨骼肌再生能力的影响选用幼龄鼠与老龄鼠分别构建骨骼肌冰冻损伤模型,于术后第5、10天取材。HE染色再生肌纤维横截面积以量化骨骼肌再生能力;使用ELISA、Western、qRT-PCR、PCR芯片分析低氧通路、Notch通路、骨骼肌再生相关基因的表达变化;免疫荧光染色、多普勒超声用以评估小鼠下肢血流情况;提取骨骼肌前体细胞(SMPs)进行体外诱导以探究不同年龄来源成肌细胞数量及分化差异。2.探索ARNT在骨骼肌再生过程中的作用与机制采用siRNA技术使C2C12细胞系中的ARNT基因沉默并观察细胞分化差异及相关因子的表达变化;构建骨骼肌特异性敲除ARNT基因的转基因小鼠,并对比其与野生型小鼠在骨骼肌再生、低氧通路、Notch通路、相关基因表达、血管血流、SMPs数量及分化能力等方面的差异。3.探索改善骨骼肌再生能力的方法对老龄鼠、幼龄鼠、转基因鼠、野生型小鼠分别加入低氧通路激活剂(ML228),分析各组小鼠骨骼肌再生能力的及相关通路的变化。结果:1.衰老导致骨骼肌的再生能力减弱,低氧通路相关因子、ARNT、NICD、Myogenin、Myf5,下肢血流,SMPs数量等均随年龄的增长而表达量下降,而下肢血管密度及SMPs分化能力无差异。2.沉默ARNT基因后,C2C12细胞的分化能力和相关基因表达下调。转基因鼠骨骼肌的再生能力显著下降,ARNT表达受抑制,HIF-1α入核减少、NICD含量和MyoD、Myogenin、Myf5基因的表达均下降。而下肢血管密度、血流及SMPs数量和分化能力无变化。3.老龄鼠和转基因鼠在加入ML228后骨骼肌再生能力显著增强,HIF-1α核异位,Notch通路及相关基因的表达量上调,下肢血管密度、血流无变化;而ML228对幼龄鼠及野生型小鼠的骨骼肌再生无促进作用。结论:ARNT随年龄的增长而表达下降是造成老龄骨骼肌再生能力降低的主要原因,其机制是与年龄相关骨骼肌内低氧通路和Notch通路受到抑制。低氧信号的药理学激活剂可以改善受损骨骼肌的再生能力,有望成为药物重塑衰老骨骼肌再生能力的新靶点。