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目的:通过探讨不同浓度的胰高血糖素(Glucagon,GC)及不同浓度葡萄糖(Glucose,Glu)刺激对胰岛β细胞系MIN6细胞中胰岛素(insulin,Ins)分泌的影响及对二脂酰甘油(Diacylglycerol,DAG)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表达的影响,进一步明确GC对胰岛素分泌的作用及机制。方法:1.对小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞进行体外培养,生长到一定细胞密度之后进行传代及分组,在不同Glu浓度即无糖(0mmol/L)、低糖(2.8mmol/L)及高糖(16.7mmol/L)和不同GC浓度即无GC(0ng/L)、低浓度GC(100ng/L)、中浓度GC(500ng/L)及高浓度GC(1000ng/L)的刺激作用下收集细胞培养皿中的上清液,采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测DAG浓度的水平;2.将敏感的荧光生物传感器CKAR(PKC表达的质粒)及阴性对照空质粒PCDNA3.1采用真核细胞电穿孔的方法转染入MIN6细胞中,在不同Glu及不同GC浓度刺激因素下采用基于荧光生物传感器的荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的技术观察细胞荧光的变化从而实时测定细胞内PKC含量的表达;3.采用ELISA法检测细胞内胰岛素分泌的水平。结果:1.ELISA法检测不同浓度Glu及不同浓度GC刺激下MIN6细胞上清液中DAG含量的结果如下:(1)在低糖和高糖浓度条件下,随着GC浓度的升高,DAG含量也随之升高,趋势明显,且高糖浓度下,DAG增加趋势较低糖浓度下增加趋势更加明显;在无糖浓度条件下高浓度GC刺激下DAG浓度没有随GC浓度升高而升高的趋势。(2)不同GC浓度组间进行比较:无糖条件下,中GC组DAG水平高于无GC组(P<0.05);低糖条件下:高、中、低GC组DAG水平均高于无GC组(P<0.05),高GC高于低GC组(P<0.001),高GC组DAG水平高于中GC组(P<0.001);高糖环境下:高、中GC组DAG水平均高于无GC组(P<0.001),高GC组DAG水平高于低GC组(P<0.001),高GC组DAG水平高于中GC组(P<0.05)。2.基于荧光生物传感器的FRET技术检测MIN6细胞内PKC含量的变化:转染空质粒:加入1000ng/LGC+16.7Glu处理组后与空白对照组kreb液相比CFP/YFP比值无明显差异P>0.05;转染PKC质粒CKAR后:(1)无糖时,在低浓度GC及中浓度GC刺激下,CFP/YFP比值曲线上升,曲线上升趋势平缓,且中浓度GC刺激下较低浓度GC刺激下CPP/YFP比值差异明显(P<0.05);高浓度GC刺激后,CFP/YFP曲线没有上升的趋势。(2)在低糖条件下,给予低浓度及中浓度GC处理CFP/YFP比值曲线上升,上升趋势平缓,且中浓度GC刺激较低浓度刺激时相比CFP/YFP比值差异明显(P<0.05);给予高浓度GC刺激后,CFP/YFP曲线继续上升,上升趋势较明显,较低浓度GC及中浓度GC刺激阶段相比比值升高(P<0.05)。(3)在高糖条件下,给予低浓度及中浓度GC处理CFP/YFP比值曲线上升,上升趋势平缓,给予高浓度GC刺激后,CFP/YFP曲线继续上升,上升趋势较明显,较低浓度GC及中浓度GC刺激阶段相比比值升高(P<0.05)。3.ELISA法检测不用浓度GC及不同浓度Glu刺激下MIN6细胞上清液中胰岛素含量的结果如下:(1)在无糖,低糖,高糖浓度下,随着GC浓度的增加,MIN6细胞胰岛素分泌量也随之增加,且随着葡萄糖浓度由低到高,胰岛素分泌量增加趋势越明显,在高糖浓度下,胰岛素浓度增加趋势最大。(2)不同GC浓度组间进行比较:无糖条件下,高、中、低GC组胰岛素浓度均高于无GC组(P<0.01),高GC组胰岛素浓度高于低中GC组(P<0.01);低糖条件下,高GC和中GC组胰岛素浓度均高于无GC组(P<0.01),高GC组高于低GC组(P<0.01);高糖条件下,高GC和中GC组胰岛素浓度均高于无GC组(P<0.05),高GC和中GC组均高于低GC组(P<0.01),高GC组高于中GC组(P<0.01);结论:1.GC可能以浓度梯度的形式通过增加第二信使信号通路DAG-PKC通路中DAG及PKC含量从而增加MIN6细胞中胰岛素的分泌。2.GC通过DAG-PKC通路增加胰岛素分泌的作用具有一定的葡萄糖依赖性。