论文部分内容阅读
研究背景高血压是最常见的心脑血管慢性病,也是引发心脑血管风险最主要的危险因素,常与胰岛素抵抗、肥胖和血脂紊乱等并存,成为心血管危险因素的集合,统称为心脏代谢综合征。随着生活方式和饮食结构的改变,以胰岛素抵抗为主要病理基础的代谢综合征患病率逐年增加。目前对于高血压伴胰岛素抵抗患者达到目标血压130/80mmHg,几乎都需联合治疗。另外,潜在的降压西药的不良反应在很大程度上影响了患者的服药依从性,临床仍有相当一部分高血压伴胰岛素患者效果并不理想,需要中医药干预。根据我们的前期研究,由于现代临床对高血压疾病的早期诊断、降压西药的早期干预以及广泛运用,使升高的血压被迅速控制,直接改变了高血压病的自然进程。高血压病的中医学病机演变规律已经发生了很大变化,既往从肝论治高血压的临床思路已经具有一定的局限性。进一步研究发现,肾虚为其现代病机关键,是当前中医治疗高血压病面临的新问题,而补肾降压是治疗此病的重要治则治法。经临床实践验证,基于补肾治则治法而形成的经验方“补肾降压方”不仅能有效降压,改善肾虚证,提高患者服药依从性,还对高血压伴胰岛素抵抗有一定的效果。这一效果也在补肾方药治疗高血压伴胰岛素抵的同类研究中得到广泛验证。但目前针对补肾方药治疗高血压伴胰岛素作用机制的研究甚少。新近研究表明微小RNA(miRNA)在心血管疾病中的具有重要作用,为疾病的治疗提供更有效、特异的靶点。其中,miR-145对脂联素mRNA和蛋白表达都有明显影响,后者是胰岛素敏感性激素,是体内调节正常胰岛素敏感性和糖稳态不可缺少的物质。其可通过加强胰岛素介导的胰岛素受体酪氨酸磷酸化,使胰岛素受体底物1(IRS-1)的酪氨酸残基磷酸化增加,磷酸化的IRS-1募集并激活PI3K/Akt,导致脂肪酸氧化及葡萄糖的摄取增加。因胰岛素相关PI3K/Akt信号传导通路激活同样可活化eNOS,产生NO发挥保护内皮功能,降低血压,提示miR-145可通过调控PI3K/Akt通路改善胰岛素抵抗及内皮功能,参与血压、血糖的调节,可能为补肾方药作用的新靶点,为合理降压、改善胰岛素抵抗提供新的科学依据。研究目的1、探讨补肾降压方对自发性高血压大鼠血压及胰岛素抵抗的作用,明确补肾方药能否改善高血压伴胰岛素抵抗的病理进程。2、探讨miRNA-145调控自发性高血压大鼠胰岛素PI3K/Akt信号传导机制,研究补肾降压方对miRNA-145调控自发性高血压大鼠胰岛素PI3K/Akt信号通路干预的作用机理,探讨补肾降压方治疗高血压伴胰岛素抵抗的作用新靶点。研究方法1、第一部分：将实验动物分为以下六组：补肾大、中、小剂量组,阳性对照药卡托普利组,自发性高血压大鼠(SHR)空白组及wistar大鼠(WKY)正常组。通过给予补肾降压方大、中、小剂量及卡托普利干预自发性高血压大鼠模型,观察SHR血压变化,并与WKY正常组相对照；用葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖含量；用放射免疫分析法测定血清胰岛素水平；运用ISI=ln[1/(FPGxFINS)]公式计算胰岛素敏感性；HE染色观察心脏病理变化。2、第二部分：用Elisa方法测定SHR空白组、各SHR给药组以及WKY正常组血清IRS-1、脂联素水平；用Western blot方法测定SHR空白组、各SHR给药组以及WKY正常组PI3K/Akt信号通路关键蛋白Akt及其两种磷酸化蛋白形式(p-Akt Thr308及p-Akt Ser473)蛋白表达量的变化；用实时荧光定量PCR (Real time PCR)技术检测SHR空白组、各SHR给药组以及WKY正常组心脏中miR-145的表达水平及eNOS mRNA基因表达水平。实验数据使用SPSS18.0统计软件包进行统计分析。结果1、第一部分：(1)给药8周后,各组SHR大鼠血压仍高于WKY组,差异有统计学意义(P<0.05)；卡托普利组及补肾大、中、小剂量组分别与SHR空白组相比较,血压均有不同程度的降低,差异有统计学意义(P<0.05)。其中卡托普利组降压幅度明显,与补肾中、小剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05),而与补肾大剂量组比较则无差异(P>0.05)；(2)给药8周后,各组SHR大鼠FPG、FINS仍高于WKY组,ISI仍低于WKY组,差异有统计学意义(P<0.05)；与空白对照组比,卡托普利组与补肾大、中剂量组都可降低大鼠FPG、FINS,提高ISI,差异有统计学意义(P<0.05)。与卡托普利组相比,补肾大、中剂量组均无差异(P>0.05)(3)各SHR用药组大鼠心肌细胞肥大、凋亡、坏死减轻,细胞排列相对整齐,改善程度以补肾大剂量组最为显著。2、第二部分：(1)Elisa测定结果：①与SHR空白组相比,WKY组及各组SHR给药后血清IRS-l均有显著升高(P<0.001)。与卡托普利组相比,补肾大、中剂量组血清IRS-1含量均升高(P<0.05)。与WKY组比较,SHR空白组IRS-1含量低(P<0.001),其余四组SHR的IRS-1含量均升高(P<0.05);②与SHR空白组相比,各组SHR给药后血清脂联素水平均有显著升高(P<0.01)。与卡托普利组比,补肾大剂量组及WKY正常组血清脂联素含量升高(P<0.05)。与WKY组比较,补肾大剂量组血清脂联素水平差异无统学意义(P>0.05),其余各组SHR给药后血清脂联素水平均低于WKY组(P<0.05)。(2)Western blot测定结果：①与SHR空白组比较,补肾大剂量组心脏Akt相对蛋白含量升高(P<0.05),其余各组SHR及WKY组均见差异(P>0.05)。与卡托普利组比较,补肾大剂量组心脏Akt相对蛋白含量升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。与WKY组比较,补肾大剂量组心脏Akt相对蛋白含量升高(P<0.05),其余各组SHR未见统计学差异(P>0.05)。②与SHR空白组比较,卡托普利组与补肾大、中、小剂量组心脏p-Akt(Thr308)相对蛋白含量均有显著升高(P<0.01)。其中补肾大剂量组升高最为明显,其含量高于其余三组SHR及WKY组,且与卡托普利组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与WKY组比较,SHR空白组p-Akt(Thr308)相对蛋白含量低,其余四组SHR的p-Akt(Thr308)相对蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。③与SHR空白组比较,补肾大、中剂量组及WKY组p-Akt(Ser473)相对蛋白含量均有显著升高(P<0.01),卡托普利组及补肾小剂量组则未见差异(P>0.05)。与卡托普利组比较,补肾大、中剂量组及WKY组p-Akt(Ser473)相对蛋白含量升高(P<0.01)。与WKY组比较,SHR空白组、卡托普利组及补肾小剂量组p-Akt(Ser473)相对蛋白含量低,其余两组SHR的p-Akt(Ser473)相对蛋白含量高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3) Real time PCR测定结果：与SHR空白组相比,补肾大、中、小剂量组、卡托普利组、WKY组组间比较有统计学意义(P<0.05)；miR-145、eNOS在各组间的表达：SHR空白组<补肾小剂量组<补肾中剂量组<卡托普利组<补肾大剂量组<WKY组。结论1.高血压伴胰岛素抵抗是一个复杂的过程,补肾降压方可在降低血压的同时,改善胰岛素抵抗,减轻靶器官损害。2.miR-145可促进脂联素表达,从而作用于胰岛素PI3K-Akt信号通路,参与血压、血糖的调节。补肾降压方对miR-145调控胰岛素PI3K/Akt信号通路具有促进作用,miR-145及其调控的胰岛素PI3K/Akt信号通路可能成为为中医药改善高血压伴胰岛素抵抗的新靶点。