蛛网膜下腔出血后交通性脑积水因其运动、认知和括约肌功能等障碍而严重威胁患者的生存质量和预后。有效治疗脑积水,有赖于对其发病机制和病理结构变化更深的认识。发生交通性脑积水时神经系统可出现一系列的病理变化导致神经功能障碍,目前关于交通性脑积水的神经病理学研究多集中于脑室周围白质和海马结构神经细胞的变化,有关交通性脑积水后皮层神经元病理变化鲜有报道。在动物脑积水发展早期可以发现胶质细胞增生的一些证据以及一些促进神经细胞恢复的蛋白因子,而神经细胞死亡数量很少。大多数高级神经功能都有赖于大量环路和投射的建立。通过突触进行的神经递质的传递是一切神经元回路的基础。神经元的功能依赖于神经递质的传导。如果皮层神经元结构变化特别是树突退化和突触数量的减少,神经环路和神经投射的形成则受到抑制,进而影响皮层的运动、感觉和高级神经功能。Leggio等的研究证实痴呆与皮层突触数量的减少有明确关系。Li等在脑外伤动物模型中采用免疫组化方法,发现了皮层和海马神经元树突退化；Swann等在癫痫中也发现了皮层神经元树突退化和棘状突减少。但迄今为止,对于交通性脑积水的皮层神经元轴突、树突和突触的神经病理变化还鲜有报道。近些年来,转化生长因子-β1 (TGF-β1)及其介导的信号转导通路在交通性脑积水发病过程中的作用越来越成为人们关注的热点。TGF-β1是具有广泛生物学活性的细胞因子,参与多种生物学过程诸如胚胎发育、间质纤维化、肿瘤发生发展和炎症修复反应等。目前较多的学者认为：蛛网膜下腔出血后,血小板释放的TGF-β1可促进室管膜下星形胶质细胞过度分泌细胞外基质蛋白,并沉积在蛛网膜下腔、蛛网膜颗粒、脉络丛以及室管膜下血管间隙,造成蛛网膜下腔的粘连和闭塞,阻碍脑脊液的回吸收,并最终导致交通性脑积水的发生。信号转导通路是细胞生物学行为调控的基础,在交通性脑积水发病过程中,TGF-β1究竟通过何种信号转导途径调控星形胶质细胞的生物学行为并最终导致蛛网膜下腔的粘连和闭塞,目前尚不清楚。我们通过前期的蛋白印迹实验发现,TGF-β1可使大鼠星形胶质细胞Smad2/3蛋白磷酸化水平显著增加,并促进细胞外基质fibronectin表达上调,提示TGF-β1可能激活星形胶质细胞TGF-β1/Smad2/3通路。因此进一步研究激活的TGF-β1/Smad2/3通路对皮层神经元的影响,将有助于探明交通性脑积水的病理生理机制,并为临床上寻找新的治疗靶标提供坚实的理论依据。同时有资料表明,TGF-β1刺激星形胶质细胞和小胶质细胞增生引起胶原过度沉积,形成胶质瘢痕从而阻碍神经再生和功能的重建,影响了后期功能的恢复。本研究采用Cherian et al方法,制作了脑积水模型,并利用子宫内电穿孔技术观察了脑积水后神经元结构的病理变化,通过体外实验研究了TGF-β1对神经元生长和投射到影响,还分别使用smad2和smad3抑制剂干预动物模型,并观察脑积水发生率和神经元结构的病理变化是否受到影响。第一部分实验性交通性脑积水后皮层神经元轴突、树突和突触的变化目的：研究实验性蛛网膜下腔出血后交通性脑积水皮层神经元轴突、树突和突触结构的病理变化。方法：首先应用子宫内电穿孔技术将EGFP基因转染于Wistar大鼠皮层神经元。7日龄Wistar大鼠60只(经子宫内电穿孔转染EGFP基因后),出自6窝,雌雄不拘,随机分为脑积水组(侧脑室注射静脉血)和对照组(侧脑室注射人工脑脊液),每组各30只。采用Cherian et al方法,选择出生后7天健康Wistat大鼠,将抗凝静脉血通过立体定向定位后注射入侧脑室,制作蛛网膜下腔出血后脑积水模型。于术后2周和3周分别应用Hoechest染色验证脑积水的发生。应用免疫组化检测GFAP和GFP的表达。于激光共聚焦显微镜下检测皮层神经元轴突、树突和突触的变化情况。同时观察皮层神经元发生细胞死亡数量。结果：在手术后2周,15只注射静脉血动物9只出现明显脑室扩大,脑积水动物GFAP表达增强,而神经元轴突、树突长度缩短,棘状突数量显著降低(P<0.05)。在手术后3周,15只注射静脉血动物8只出现明显脑室扩大,脑积水动物GFAP表达增强,而神经元轴突、树突长度缩短,棘状突数量显著降低(P<0.05)。手术后3周与手术后2周形成脑积水动物相比,棘状突数量下降比例大致相同。未发现明显皮层神经元细胞死亡现象。结论：本课题首次将子宫内电穿孔技术应用于交通性脑积水的研究中,发现蛛网膜下腔出血后交通性脑积水发生后除脑室周围白质受到影响外,距离脑室较远的皮层神经元的发育也受到显著影响,神经元受损并不表现为细胞的死亡,而是表现为神经元轴突、树突和突触发生退变,这可能是脑积水后各种神经功能缺失的重要病理基础。以上结论既往研究未见报道。第二部分TGF-β1/Smad2/3信号传导通路对实验性交通性脑积水后神经元形态的影响目的：研究TGF-β1/Smad2/3信号通路对实验性蛛网膜下腔出血后脑积水形成的影响以及对皮层神经元轴突、树突和突触的影响。方法：将已经电转GFP的胚胎Wistar大鼠海马神经元用TGF-(31(10ng/ml)进行24小时预先干预,对照组不进行干预,利用细胞培养技术将鼠胚胎海马神经元于体外培养3天,分别应用TAU蛋白免疫组化染色,光镜下观察TAU表达阳性细胞,计算阳性细胞百分率并进行显微摄影。7日龄Wistar大鼠80只(经子宫内电穿孔转染EGFP基因后),出自10窝,雌雄不拘,随机分为对照组(侧脑室注射人工脑脊液)、脑积水组(侧脑室注射静脉血)、Smad2抑制剂治疗组(侧脑室注射静脉血和smad2抑制剂)和Smad3抑制剂治疗组(侧脑室注射静脉血和smad3抑制剂),每组各20只。采用Cherian et al方法,选择出生后7天健康Wistat大鼠,将抗凝静脉血通过立体定向定位后注射入侧脑室,制作蛛网膜下腔出血后脑积水模型。干预组动物在注射静脉血同时分别注射smad2和smad3抑制剂。术后2周每组15只检测形态学变化,应用Hoechest染色验证脑积水的发生,应用子宫内电穿孔技术检测皮层神经元轴突、树突和突触的变化情况。每组另外5只应用Western blot检测TGF-β1、Smad2、Smad3和fibronectin的表达。结果：体外实验发现,经TGF-β1预先治疗的神经元细胞轴突长度和投射数量显著低于对照组(P<0.01)。在体实验方面,在手术后2周,15只对照组动物未出现脑室明显扩大,15只smad2抑制剂注射组动物中8只出现脑室明显扩大,15只smad3抑制剂注射组动物中8只出现脑室明显扩大,而15只只注射静脉血动物中9只出现脑室明显扩大,三组间脑积水发生率无显著差异。在神经元损伤方面,注射smad2抑制剂注射组形成脑积水动物中皮层神经元轴突、树突和突触的变化与只注射静脉血形成脑积水动物相比无显著性差异；而注射smad3抑制剂注射组形成脑积水动物中皮层神经元轴突长度和树突长度的缩短程度较只注射静脉血形成脑积水动物轻,但无显著性差异,而树突棘(突触)数量减少程度(22%)较只注射静脉血形成脑积水动物(30%)显著降低(P<0.05)。Western blot检测显示脑积水组、smad2抑制剂注射组和smad3抑制剂注射组TGF-β1表达均较对照组显著增强(P<0.01),smad2抑制剂注射组smad2蛋白表达较只注射静脉血动物显著降低,而smad3抑制剂注射组smad3蛋白和fibronectin蛋白表达较只注射静脉血动物显著降低(P<0.01)。结论：体外实验证实TGF-β1可以抑制皮层神经元轴突的生长和投射,并使其发生退行性变。在体实验方面,虽然选择性抑制smad2和smad3无法逆转蛛网膜下腔出血后脑积水的形成,但是smad3抑制剂可以使脑积水后神经元损伤程度降低,这表明通过早期干预,交通性脑积水后皮层神经元的退行性变的病理过程可以被逆转,交通性脑积水患者的神经功能障碍有望得到缓解。TGF-β1/Smad2/3信号传导通路可能通过诱导细胞外基质蛋白fibronectin的表达从而调控皮层神经元的突触形成,其具体机制尚须进一步研究。全文结论：本课题首次将子宫内电穿孔技术应用于交通性脑积水的研究中,发现蛛网膜下腔出血后交通性脑积水发生后除脑室周围白质受到影响外,距离脑室较远的皮层神经元的发育也受到显著影响,神经元受损并不表现为细胞的死亡,而是表现为神经元轴突、树突和突触发生退变,这可能是脑积水后各种神经功能缺失的重要病理基础。体外实验证实TGF-β1可以抑制皮层神经元轴突的生长和投射,并使其发生退行性变。在体实验表明,虽然选择性抑制smad2和smad3无法逆转蛛网膜下腔出血后脑积水的形成,但是smad3抑制剂可以使脑积水后神经元损伤程度降低,这表明通过早期干预,交通性脑积水后皮层神经元的退行性变的病理过程可以被抑制,交通性脑积水患者的神经功能障碍有望得到减轻。TGF-β1/Smad2/3信号传导通路可能通过诱导细胞外基质蛋白fibronectin的表达从而调控皮层神经元的发育和投射形成,其具体机制尚须进一步研究。