肿瘤微环境是机体肿瘤细胞发生、生长及转移的内环境,由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、各种胶质细胞以及其邻近区域的细胞间质、新生血管和各种生物分子组成。错综复杂的肿瘤微环境产生的炎症特性有利于肿瘤细胞的生长、转移和新生血管的生成等,促使恶性肿瘤的产生与发展。免疫细胞在肿瘤微环境的增殖、浸润及其功能的发挥是机体抗肿瘤免疫应答的基础,其中以CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),CD4+辅助性T淋巴细胞(Th)的浸润为主。浸润的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞通过分泌多种效应分子如IFN-γ、perforin等发挥抗肿瘤免疫应答,与患者的预后密切相关。但是机体肿瘤微环境中复杂的负性调控机制,如免疫卡控点分子PD-1、PD-L1、CTLA-4、Tim-3等分子在肿瘤细胞和微环境中免疫细胞的表达使肿瘤浸润CD4+Th1、CD8+CTLs功能耗竭,处于无能状态,不能很好地对肿瘤细胞实行免疫监视和杀伤效应。因此,改变肿瘤微环境的免疫抑制状态,重新活化浸润的免疫细胞,逆转耗竭无能的状态,成为当前肿瘤免疫治疗的热点话题。PD-1/PD-L1负性免疫卡控点分子在肿瘤免疫治疗的研究是国内外热点话题。在肿瘤微环境中,PD-1/PD-L1以受体/配体形式结合,通过抑制淋巴细胞的活化和增殖,使淋巴细胞功能耗竭,产生IL-10等免疫抑制性分子,并导致肿瘤特异性T淋巴细胞发生凋亡,诱导初始CD4+T细胞向Foxp3+Treg细胞方向分化,产生免疫抑制,从而使得肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。因此,近年来,许多临床试验运用PD-1/PD-L1抗体抑制剂阻断性疗法,恢复耗竭淋巴细胞的效应功能,使其重新刺激活化产生抗肿瘤免疫应答疗效。目前,多项临床研究试验均已表明,抗PD-1/PD-L1疗法能够逆转处于晚期及转移性肿瘤的状态,显著提高肿瘤患者的生存率。该疗法效果持久,一旦有效不容易耐受,对多种实体瘤均有显著疗效。虽然PD-1/PD-L1抗体单一疗法已显示出比较显著的疗效,但是其仅对部分患者表现出临床效应,有效率在20%左右,部分患者对该疗法效果不显著甚至无效。因此,寻找一种PD-1抗体的联合疗法已成为至关重要的问题。细胞因子白细胞介素33(IL-33)是1999年被首次发现的分子量为30k Da的蛋白,起初被称为“高内皮微静脉核因子”,后于2005年经Schmitz等科学家发现并证实IL-33是IL-1家族的新型成员,其受体是ST2和IL-1受体辅助蛋白组成的二聚体。最初的文献报道,IL-33/ST2主要参与Th2型炎症、抗病毒免疫应答的过程。而后的研究表明,IL-33/ST2通路也可以促进Th1型免疫应答,增强抗原特异性CD8+T细胞的功能,在抗肿瘤应答过程中具有重要的效应功能。基于本课题组前期的研究,IL-33协同TCR信号和白介素12(IL-12),能够体外刺激活化CD4+/CD8+T淋巴细胞,促进其分泌IFN-γ,并且在荷瘤小鼠模型中,肿瘤微环境中IL-33的表达能够增加T淋巴细胞的浸润,增强其分泌IFN-γ的能力,显著抑制肿瘤的生长及转移。因此,本课题旨在借助荷瘤小鼠模型,探讨PD-1单克隆抗体与细胞因子IL-33联合应用,观察肿瘤的生长及小鼠的生存情况,进一步分析PD-1单克隆抗体联合细胞因子IL-33介导肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答的机制,以期为临床肿瘤免疫治疗提供新的策略和思路。【目的】探讨PD-1免疫卡控点分子阻断性疗法联合细胞因子白细胞介素33(IL-33)对荷瘤小鼠肿瘤的生长及小鼠生存期的影响及其可能的机制。【方法】1、于Humanized PD-1 KI/KO小鼠腹部外侧接种2×105 B16或B16-IL33肿瘤细胞,构建黑色素瘤小鼠模型,于肿瘤细胞接种的第5天开始,每隔4天在肿瘤生长对侧腹腔注射Ig G或人源化(Humanized)PD-1 m Ab 200?g/100?l,共治疗4次,观察荷瘤小鼠肿瘤生长与生存情况,绘制肿瘤的生长曲线与生存曲线;2、在肿瘤生长早期(二次治疗后)、中晚期(四次治疗后)、晚期,经免疫荧光标记技术、流式细胞术来检测肿瘤微环境CD45+细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的浸润以及各免疫细胞亚群IFN-γ、Foxp3、Ki-67等的表达与分泌;3、采用Real-time PCR在m RNA水平检测IFN-γ、GZ-B、perforin等的表达;4、经免疫荧光技术(immunofluorescence)观察肿瘤组织(frozen section)CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的浸润。【结果】1、PD-1 m Ab阻断联合细胞因子IL-33在B16小鼠肿瘤模型中显著抑制肿瘤生长,差异具有统计学意义,且与PD-1单抗单一疗法相比,差异更显著,P<0.05;2、PD-1 m Ab阻断联合细胞因子IL-33治疗显著延长黑色素瘤小鼠生存期,差异具有统计学意义,P<0.05;3、PD-1 m Ab阻断联合细胞因子IL-33治疗组肿瘤微环境中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞浸润增加,差异具有统计学意义,P<0.05;4、在肿瘤生长早期,治疗组IFN-γ+CD8+T细胞的比例明显多于对照组,且联合组效应更明显,差异具有统计学意义(P<0.01),IFN-γ+CD4+T细胞表达组间未见明显差异。在肿瘤生长中晚期,各组IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞比例均有增加,尤以PD-1 m Ab治疗组跟联合组的比例最高,差异具有统计学意义,P<0.05;5、在肿瘤生长早期,PD-1 m Ab联合细胞因子IL-33治疗组肿瘤微环境中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞Ki-67表达水平增加,差异具有统计学意义,P<0.05;在肿瘤生长中晚期,各组间Ki-67表达水平未见明显差异;6、在肿瘤生长中晚期,PD-1 m Ab联合细胞因子IL-33治疗组肿瘤微环境中髓系来源抑制细胞(MDSC)比例明显减少,且其表达MHC II类分子的水平增加,差异具有统计学意义,P<0.05;7、在肿瘤生长早期、中晚期,经Real-time PCR在m RNA水平分析IFN-γ、GZ-B、perforin的表达,发现PD-1 m Ab联合细胞因子IL-33治疗组IFN-γ、GZ-B、perforin表达明显上调,差异具有统计学意义,P<0.05,P<0.01,P<0.001。【结论】PD-1免疫卡控点阻断疗法联合细胞因子IL-33能够增强肿瘤微环境中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的增殖,从而促进CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞浸润肿瘤组织,分泌与表达IFN-γ、GZ-B、perforin等效应分子杀伤肿瘤细胞,增强机体抗肿瘤免疫应答;同时,该联合疗法能够通过抑制体内髓系来源抑制细胞(MDSC)重新刺激活化T淋巴细胞,使其恢复机体效应功能,从而显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并且延长其生存期。