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L-苹果酸作为重要的平台化合物已经被广泛的应用于食品、医药和化妆品等领域。近年来,生物法生产L-苹果酸已经成为了最具前景和高效性的苹果酸生产方法,包括酶转化法和微生物发酵法等。相较与酶转化法,微生物发酵法具有底物选择性更多、生产成本更低、产酸效率更高等优势。目前,发酵法生产L-苹果酸已经取得了显著的进展,但仍然存在食品安全性菌株选择性少、得率或生产强度较低、廉价原料利用不充分、杂酸水平较高等问题亟待解决。本研究以丝状真菌米曲霉作为生产菌株,利用代谢工程手段分别调控了L-苹果酸的胞质合成和转运途径、玉米淀粉的底物利用途径、L-苹果酸的线粒体合成途径、杂酸的合成和转运途径等,实现了苹果酸的高效合成。主要研究结果如下:(1)以米曲霉NRRL 3488作为出发菌株,以葡萄糖为发酵底物,通过强化L-苹果酸的胞质合成途径,提高了L-苹果酸的生产强度。通过过表达丙酮酸羧化酶PYC和苹果酸脱氢酶MDH的编码基因,L-苹果酸的摇瓶产量由26.1 g/L提高至42.3 g/L。为了平衡rTCA途径,引入细菌中草酰乙酸回补途径,通过共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,L-苹果酸的产量提高至58.5 g/L,生产强度为0.65 g/L/h。(2)通过过表达米曲霉自身的四碳二羧酸转运蛋白C4T318和粟酒裂殖酵母的苹果酸转运子SpMAEI,增强L-苹果酸向胞外的转运,L-苹果酸的产量显著提升至89.5 g/L。将C4T318分别定位至线粒体内膜和线粒体基质中,细胞干重(DCW)、菌球直径和L-苹果酸的产量均明显下降。经基因转录水平分析,6-磷酸果糖激酶的编码基因pfk受到了高浓度代谢产物的反馈阻遏。使用组成型强启动子过表达pfk基因,L-苹果酸的摇瓶产量提高至93.2 g/L,生产强度为1.17 g/L/h。(3)通过碳氮源优化,米曲霉MT2-P可直接发酵100 g/L玉米淀粉生产56.6 g/L L-苹果酸。分别过表达深层发酵时三个关键的淀粉水解酶基因agdA、amyB和glaA,均有利于提高玉米淀粉的发酵效率。为了进一步提高glaA基因的表达水平,将启动子PglaA中97-bp的核心功能区序列重复串联了5个拷贝,实现了其启动强度优于初始启动子。使用重组启动子同时过表达三个淀粉水解酶基因,米曲霉GAA可发酵100 g/L玉米淀粉生产72 g/L L-苹果酸。若调整发酵底物中葡萄糖与玉米淀粉的比例为3:7,L-苹果酸的产量为77 g/L。(4)分别测定发酵过程中细胞质和线粒体内有机酸的积累情况,发现细胞质中积累的主要产物为苹果酸、琥珀酸、富马酸和丙酮酸,而线粒体中仅存在稍低浓度的苹果酸、富马酸和丙酮酸,无明显量琥珀酸的积累。为了减少富马酸的积累,过表达了来源于酿酒酵母的富马酸酶FUMI,重组菌GAAF41可发酵130 g/L玉米淀粉生产88.5 g/L苹果酸,同时富马酸和琥珀酸的浓度分别降至9.2 g/L和0.79 g/L,丙酮酸的浓度由0.1~0.5 g/L提高至1.2 g/L左右。将来源于米根酶的PYC同时定位到细胞质和线粒体中,苹果酸的产量最高达95.1 g/L。同时,琥珀酸和富马酸的浓度分别降至6.9 g/L和0.6 g/L,胞内仅能检测出微量的丙酮酸。与提高氧化TCA的代谢通量相比,强化乙醛酸循环的代谢,苹果酸的产量提高至99.8 g/L,琥珀酸的浓度为8.3 g/L。利用RNA干扰技术在产酸期干扰TCA循环的第一步反应,可有效引导更多的碳流向还原代谢途径,苹果酸的产量提高至105.3 g/L,琥珀酸和富马酸的浓度也分别提高至9.5 g/L和1.31 g/L。(5)在线粒体内膜上表达S.cerevisiae的二羧酸转运蛋白Sfc1p,将胞质内的部分琥珀酸转运至线粒体后,在菌株PGRS的线粒体中检测到了1.89 g琥珀酸/g DCW。琥珀酸和富马酸的浓度降低至6.0 g/L和0.7 g/L,苹果酸的产量提高至109.1 g/L。表达LlNOX在一定范围内降低NADH与NAD的比值,有效降低琥珀酸的浓度至3.8 g/L,降低了36.7%,L-苹果酸的产量达到了117.2 g/L。