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背景：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是当今仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的第二大神经系统退行性疾病。PD的发病机制复杂,尚未完全明确,目前认为可能与老年化、环境因素(比如MPTP.除草剂、杀虫剂、金属等)和遗传因素相关。随着分子遗传学的发展,遗传因素在PD发病机制中的作用越来越受到关注,至少有13个致病基因被克隆,其中α-synucelein、LRRK2、 PRKIN、DJ-1、PINK1以及ATP13A2作为PD的致病基因已经得到了较为一致的肯定。这些基因的功能涉及到了氧化应激、线粒体功能缺陷、泛素蛋白酶体系功能障碍等方面。2001年Hampshire等对一例呈常染色体隐性遗传的合并有痴呆、核上性凝视麻痹的约旦PD家系进行了联锁定位分析,将其致病区间定位于1p36的一个9cM的区域,命名为PARK9。2006年Ramirez等在该家系患者中发现ATP13A2基因的致病突变,且存在家系共分离,从而克隆了PARK9的致病基因。其后,研究者们对不同国家和不同种族来源的PD患者进行了该基因的筛查,不断有新的病例报道。ATP13A2基因(OMIM*610513)定位于人类染色体1p36,包括三个剪切本,其编码的蛋白属于P型ATPase蛋白超家族,该家族主要参与无机离子的跨膜转运。近年来,对于遗传退行性疾病致病基因的转录调控得到越来越多的重视,转录因子可以通过对致病基因的转录调节从而参与疾病的发病机制,比如转录因子GATA能够与SNCA基因启动子区结合,从而使得该基因表达显著上调。目前,转录因子已成为遗传退行性疾病治疗研究的一个新兴的靶点。尽管ATP13A2作为PD的致病基因已经得到了一致的肯定,关于ATP13A2蛋白的转录调控却不明确。为了研究其转录调控的相关分子机制,本研究拟对ATP13A2基因转录起始位点定位并初步分析该基因启动子区活性特点,进而研究其启动子区转录因子结合情况,深入研究感兴趣的转录因子对ATP13A2基因转录的调节。目的：研究ATP13A2基因转录调控的相关分子机制。方法：1.运用RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增法(RNA ligase mediated rapid amplification of cDNA ends, RLM-RACE)确定人类ATP13A2基因的转录起始位点(transcription start site, TSS);2.构建连接有不同长度ATP13A2基因启动子区序列的重组荧光素酶报告基因质粒,采用Dual-luciferase reporter assay system对质粒的启动子活性进行检测；3.运用在线软件结合手工分析,预测ATP13A2基因启动子区潜在的转录因子结合位点；4.采用凝胶电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)以及染色质免疫共沉淀分析(chromatin immunopreci-pitation assay, ChIP)对预测的感兴趣的转录因子缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor1α, HIF-1α)结合位点—缺氧反应元件(hypoxia response element, HRE)进行验证；5.运用HIF-1α蛋白表达质粒pHA-Hif-1α与含ATP13A2启动子的重组荧光素酶报告基因质粒pPK9-A共转染或给予pPK9-A转染的细胞缺氧处理(2%02),观察HIF-1α和缺氧对于ATP13A2基因启动子区活性的影响；6.给予HEK293细胞以及小鼠多巴胺能神经元细胞模型MN9D细胞缺氧处理(2%02),并结合半定量RT-PCR技术,检测两种细胞株内源性ATP13A2mRNA水平,以进一步观察缺氧对ATP13A2转录水平的调控作用。结果：1.对RLM-RACE方法获得的PCR产物测序显示与RNA adapter序列相连的第一位碱基为位于ATP13A2翻译起始位点ATG上游206bp的腺嘌呤A；2.构建了一系列连接有ATP13A2基因启动子区片段的重组pcDNA3质粒,命名为pPK9-A至pPK9-J,其中最长的片段长度为2.0kb(-1954至+84bp,将TSS定位为+1)；对这些质粒的启动子活性分析表明质粒pPK9-A(-1954至+84bp)、pPK9-C(-1538至+84bp)、pPK9-E(-846至+84bp)、pPK9-F(-201至+84bp)、pPK9-G(-78至+84bp)、pPK9-H(-78至+50bp)具有显著的启动子活性；3.通过转录因子结合位点预测软件分析同时结合手工比对,结果显示在人类ATP13A2基因启动子区-1954至+84bp这-区间内包含有9个5’-A/GCGTG-3’序列,并依次命名为HRE1至HRE9；4. EMSA结果显示HRE-1、HRE-3、HRE-4、HRE-8以及HRE-9的寡居核苷酸能够显著的减弱HIF-1α探针与HIF-1α蛋白形成的DNA-蛋白复合物迁移带的浓度；ChIP结果显示HRE-1、HRE-3+4、HRE-8+9的特异性引物能够从HIF-1α特异性抗体免疫共沉淀后分离纯化的DNA样品中成功扩增出目的片段；5.相对于空白质粒共转染的阴性对照,pPK9-A与质粒pHA-Hif-1α共转染显著增加了pPK9-A的启动子活性(2.483±0.241,p<0.05)；相对于正常氧含量培养的阴性对照,pPK9-A转染的HEK293细胞经过缺氧培养(2%02)显著增加了pPK9-A的启动子活性(2.466±0.293,p<0.05)；6.给予HEK293细胞缺氧处理(2%02)Oh、12h、24h及48h后检测细胞内源性ATP13A2的RNA水平,结果在显示缺氧24h及48h情况下,其mRNA水平显著增高(分别为2.356±0.320、2.526±0.203,P值均<0.05)；给予MN9D细胞缺氧处理(2%02)Oh、12h、24h后检测细胞内源性Atp13a2mRNA水平,结果显示缺氧12h及24h情况下,其RNA水平显著增高(分别为1.668±0.148、1.606±0.130,P值均<0.05)。结论：1.人类ATP13A2基因的主要转录起始位点为位于该基因翻译起始位点ATG上游206bp的腺嘌呤A；2.ATP13A2基因-78至+50bp的启动子区域含有ATP13A2基因转录所必须的核心启动子序列；3. EMSA和ChIP分析证实ATP13A2基因启动子区存在功能性的HRE位点,能够与转录因子HIF-1α相结合；4.转录因子HIF-1α能够与ATP13A2基因启动子区的HRE位点相结合,对ATP13A2基因的启动子活性进行调控；5.缺氧可以通过转录因子HIF-1α对ATP13A2基因的转录起到上调作用。