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目的：
创伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）是导致创伤性死亡和残疾的主要原因，TBI会导致神经炎症和血脑屏障破坏，造成严重的神经功能损伤。研究发现羟氯喹（Hydroxychloroquine，HCQ）具有抗炎作用和潜在的神经保护作用，然而HCQ在TBI后神经功能损伤中是否发挥作用及其具体机制未见报道。本课题主要研究了HCQ在TBI后神经功能损伤的修复作用以及对相关作用机制进行初步探讨。本文分为两部分，第一部分主要研究HCQ对小鼠TBI模型以及在体外神经炎症模型中对炎症的抑制作用及相关机制，第二部分主要研究HCQ在小鼠TBI模型中对血脑屏障的保护作用。
方法：
1、小鼠TBI模型的建立
小鼠术前禁食12h，饮水自由。称重，选20-25g雄性老鼠建模，腹腔注射4%水合氯醛(10mL/kg)麻醉，麻醉后用剃毛机剃除小鼠头部毛发，并将其固定在脑立体定位仪上。固定标准为保持头骨左右位水平和前后位切线水平。涂抹碘酒消毒后，按正中矢状走向切开头部皮肤，暴露颅骨，用3%H2O2擦拭前囟、人字点及左脑部分。于前囟后0.6mm，中线旁开1mm位置，用颅钻进行颅骨钻孔，磨出以直径4mm的正圆形骨窗，调整打击器的打击杆使其与脑接触部分垂直，确保垂直打击。使用直径为3mm的气动活塞冲击头，以4m/s的速度、1mm的深度和250ms的停留时间撞击暴露的皮质表面，用棉签拭去出血后，用5-0缝合线缝合切口。小鼠随机分成Sham组、TBI+Vehicle组和TBI+HCQ组。Sham组小鼠只进行颅骨钻孔缝合，不进行TBI损伤。Sham组、TBI+Vehicle组和TBI+HCQ组腹腔注射生理盐水或者HCQ（30mg/kg），造模结束将小鼠置于37℃保温箱中，待其苏醒后按分组移至鼠笼中饲养。TBI后24h和3d对小鼠进行mNSS神经功能评分、滚轮实验、抓力实验。3d后进行Evans蓝渗透测试和脑含水量测定。部分小鼠脑组织用于石蜡包埋的组织切片、组织蛋白质提取和总RNA提取。H&E染色评价HCQ对TBI后小鼠损伤皮质的修复作用，组织免疫荧光染色来检测紧密连接相关蛋白Iba1、MPO、CD34、ZO-1和Claudin-5的表达。蛋白免疫印迹来检测密连接相关蛋白Iba1、TNF-α、iNOS、TLR4、p-NFκB、NFκB、p-IκBα、IκBα、ZO-1和Claudin-5的表达。RT-PCR检测炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的表达。
2、体外炎症模型的建立
BV2细胞使用DMEM4.5g完全培养基培养下，长至培养皿60%左右后，各实验组换上新的完全培养基，给予LPS（100ng/mL）刺激6h建立体外炎症模型。按照实验设计，BV2细胞分成正常组（Control组）、LPS刺激组（LPS组）以及LPS+不同剂量HCQ给药组。HCQ给药组提前1h给予HCQ，Control组不做处理，除Control组外，其余组给予LPS（100ng/mL）刺激6h，刺激完进行后续实验。使用细胞免疫荧光染色检测NFκB的表达，蛋白免疫印迹检测p-NFκB、NFκB、p-IκBα和IκBα的表达，用RT-PCR检测了炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的表达。
结果：
1、HCQ修复TBI后小鼠神经功能损伤和脑皮质损伤。体内实验发现HCQ能抑制TBI引起的脑内小胶质激活、中性粒细胞浸润和炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的产生，并通过抑制TLR4/NFκB信号通路来减轻神经炎症反应。体外实验也发现HCQ抑制炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的产生，并通过下调p-NFκB和p-IκBα的表达抑制NFκB信号通路来减轻炎症反应。因此，HCQ可以通过抑制小胶质激活以及抑制NFκB相关信号通路来抑制神经炎症。
2、HCQ能通过抑制活化小胶质细胞迁移、降低血脑屏障通透性以及上调紧密连接相关蛋白ZO-1的表达，来修复血脑屏障，保护血脑屏障完整。
3、TBI后0h、3h和6h给予HCQ都能减轻TBI后神经功能损伤。
结论：
TBI损伤导致神经炎症产生，神经炎症加重血脑屏障破坏。HCQ可以抑制小胶质激活、中性粒细胞浸润以及抑制NFκB相关信号通路来减轻神经炎症；同时抑制激活的小胶质细胞对血脑屏障的损害，降低血脑屏障通透性，上调紧密连接蛋白表达来保护血脑屏障完整性，从而达到修复TBI后神经功能损伤的目的。实验表明HCQ可能成为临床上治疗TBI后神经功能损伤的潜在药物。
创伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）是导致创伤性死亡和残疾的主要原因，TBI会导致神经炎症和血脑屏障破坏，造成严重的神经功能损伤。研究发现羟氯喹（Hydroxychloroquine，HCQ）具有抗炎作用和潜在的神经保护作用，然而HCQ在TBI后神经功能损伤中是否发挥作用及其具体机制未见报道。本课题主要研究了HCQ在TBI后神经功能损伤的修复作用以及对相关作用机制进行初步探讨。本文分为两部分，第一部分主要研究HCQ对小鼠TBI模型以及在体外神经炎症模型中对炎症的抑制作用及相关机制，第二部分主要研究HCQ在小鼠TBI模型中对血脑屏障的保护作用。
方法：
1、小鼠TBI模型的建立
小鼠术前禁食12h，饮水自由。称重，选20-25g雄性老鼠建模，腹腔注射4%水合氯醛(10mL/kg)麻醉，麻醉后用剃毛机剃除小鼠头部毛发，并将其固定在脑立体定位仪上。固定标准为保持头骨左右位水平和前后位切线水平。涂抹碘酒消毒后，按正中矢状走向切开头部皮肤，暴露颅骨，用3%H2O2擦拭前囟、人字点及左脑部分。于前囟后0.6mm，中线旁开1mm位置，用颅钻进行颅骨钻孔，磨出以直径4mm的正圆形骨窗，调整打击器的打击杆使其与脑接触部分垂直，确保垂直打击。使用直径为3mm的气动活塞冲击头，以4m/s的速度、1mm的深度和250ms的停留时间撞击暴露的皮质表面，用棉签拭去出血后，用5-0缝合线缝合切口。小鼠随机分成Sham组、TBI+Vehicle组和TBI+HCQ组。Sham组小鼠只进行颅骨钻孔缝合，不进行TBI损伤。Sham组、TBI+Vehicle组和TBI+HCQ组腹腔注射生理盐水或者HCQ（30mg/kg），造模结束将小鼠置于37℃保温箱中，待其苏醒后按分组移至鼠笼中饲养。TBI后24h和3d对小鼠进行mNSS神经功能评分、滚轮实验、抓力实验。3d后进行Evans蓝渗透测试和脑含水量测定。部分小鼠脑组织用于石蜡包埋的组织切片、组织蛋白质提取和总RNA提取。H&E染色评价HCQ对TBI后小鼠损伤皮质的修复作用，组织免疫荧光染色来检测紧密连接相关蛋白Iba1、MPO、CD34、ZO-1和Claudin-5的表达。蛋白免疫印迹来检测密连接相关蛋白Iba1、TNF-α、iNOS、TLR4、p-NFκB、NFκB、p-IκBα、IκBα、ZO-1和Claudin-5的表达。RT-PCR检测炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的表达。
2、体外炎症模型的建立
BV2细胞使用DMEM4.5g完全培养基培养下，长至培养皿60%左右后，各实验组换上新的完全培养基，给予LPS（100ng/mL）刺激6h建立体外炎症模型。按照实验设计，BV2细胞分成正常组（Control组）、LPS刺激组（LPS组）以及LPS+不同剂量HCQ给药组。HCQ给药组提前1h给予HCQ，Control组不做处理，除Control组外，其余组给予LPS（100ng/mL）刺激6h，刺激完进行后续实验。使用细胞免疫荧光染色检测NFκB的表达，蛋白免疫印迹检测p-NFκB、NFκB、p-IκBα和IκBα的表达，用RT-PCR检测了炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的表达。
结果：
1、HCQ修复TBI后小鼠神经功能损伤和脑皮质损伤。体内实验发现HCQ能抑制TBI引起的脑内小胶质激活、中性粒细胞浸润和炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的产生，并通过抑制TLR4/NFκB信号通路来减轻神经炎症反应。体外实验也发现HCQ抑制炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的产生，并通过下调p-NFκB和p-IκBα的表达抑制NFκB信号通路来减轻炎症反应。因此，HCQ可以通过抑制小胶质激活以及抑制NFκB相关信号通路来抑制神经炎症。
2、HCQ能通过抑制活化小胶质细胞迁移、降低血脑屏障通透性以及上调紧密连接相关蛋白ZO-1的表达，来修复血脑屏障，保护血脑屏障完整。
3、TBI后0h、3h和6h给予HCQ都能减轻TBI后神经功能损伤。
结论：
TBI损伤导致神经炎症产生，神经炎症加重血脑屏障破坏。HCQ可以抑制小胶质激活、中性粒细胞浸润以及抑制NFκB相关信号通路来减轻神经炎症；同时抑制激活的小胶质细胞对血脑屏障的损害，降低血脑屏障通透性，上调紧密连接蛋白表达来保护血脑屏障完整性，从而达到修复TBI后神经功能损伤的目的。实验表明HCQ可能成为临床上治疗TBI后神经功能损伤的潜在药物。