呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是世界范围内婴幼儿及成人呼吸道感染的首要病原，多年以来，研究工作者一直在努力寻求能够有效防治或缓解RSV感染的办法，但是到目前为止，尚没有针对RSV的可靠疫苗或特异性的抗RSV制剂问世。脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme，DZ)是一种能够抑制细胞内RNA表达的有效手段。它是通过对体外合成的随机序列库进行筛选得到的具有RNA切割功能的DNA分子。理论上，DZ能够对任意序列的RNA分子进行特异性切割。在既往的研究中，我们设计合成了两种针对RSV A亚型的特异性脱氧核酶DZ8269和DZ604，并在一系列体内、体外实验中证实了其高效抗RSV效应。本研究的主要目的是在此基础上，设计合成可广谱作用于A、B两个亚型的DZ并验证其抗病毒活性。 第一部分 抗RSV广谱脱氧核酶靶点的选择和脱氧核酶的设计合成 靶RNA中DZ切割位点的选择主要考虑三个因素。第一，该位点对病毒复制至关重要。第二，靶序列在不同的RSV株间应高度保守。第三，通过对RNA二级结构的计算机辅助分析，靶位点应容易接近，且在重庆医科大学博士学位论文摘要一个不稳定的位置以利于DZ的切割作用。根据上述靶位点选择的三个原则，我们设计合成了两种特异性10一23型nz:Dzi133和Dz76ol，分别以RSVN基因和MZ基因的基因组转录起始序列为切割靶位点。作为对照，我们设计了针对相同底物的19n和17nt的反义寡聚核昔酸 (AS 1 133、AS7601)和两个在15nt催化域有一个点突变的突变体DZ (mutDZll33和mutDZ7601)。为了提高DZ和AS的稳定性，在化学合成过程中我们对5’端和3’端的2一3个核普酸进行了硫代修饰。此外，在细胞培养模型中，我们应用了3’端连接胆固醇的方法以提高细胞的摄取并增加稳定性。第二部分脱氧核酶在无细胞体系对RSV RNA的剪切活性 背景与目的:研究DZll33和DZ7601在无细胞体系剪切靶RNA的活性，对催化反应的时效关系和离子浓度对DZ活性的影响进行评价。 方法:用RT-PeR扩增eHis537 Rsv的N基因(4o3bp)和MZ基因(402bp)的eDNA片段，将pCR扩增片段定向克隆到pBlueseript 11 KS+嗜菌粒T7启动子的下游，获得重组嗜菌粒pN一18537和pMZ一18537。以pN一18537和pMZ一 18537为模板，经体外转录获得N基因和MZ基因的单链RNA片段，作为DZ切割反应的底物。在细胞外适当的离子浓度、温度、PH值条件下将底物RNA与DZ、mutDZ、AS反应，观察在不同的时间点、不同的Mg离子浓度条件下DZ及其对照寡核昔酸的切割效率。 结果:DZll33在既定的位点将底物RNA切割，随着反应时间的延重庆医科大学博士学位论文摘要长，其切割效率逐渐增加。在模拟细胞内镁离子浓度(ZmM)条件下DZll33对底物无明显的剪切活性，当镁离子浓度从10 mM增加至25mM时，DZll33的催化活性随之增加。DZ7601不能切割其底物RNA。AS和mutDZ均无剪切活性。 结论:在无细胞系统中，DZll33能高效切割RSVN基因组RNA。切割反应具有高度的序列特异性和时间依赖性，其切割效应与镁离子浓度有关。DZ7601对RSV MZ基因组RNA没有切割效应。mutDZ和AS对靶RNA均无剪切活性。第三部分RSV重庆地方株的分离、培养与鉴定 背景与目的:分离、培养重庆地区RSV地方株并进行亚型鉴定，为下一步在感染细胞中观察DZll33针对不同亚型地方株RSV的抗病毒效应奠定基础。 方法:标本采自重庆医科大学附属儿童医院内二病房住院患儿的鼻咽分泌物。患儿临床诊断为毛细支气管炎或肺炎。经HeP一2细胞分离培养RSV，通过倒置相差显微镜观察典型的细胞融合病变、免疫荧光实验鉴定RSV分离株，RT-PCR鉴定分离株亚型，空斑形成实验测定病毒滴度。 结果:分离得到了6株重庆地区RSV流行株。RSV感染的H叩一2细胞出现典型的细胞融合病变。免疫荧光实验观察到RSV感染阳性标本的呼吸道上皮脱落细胞胞浆呈现特异性黄绿色荧光。用特异性分型引物进行Rl’- pcR，在A亚型和B亚型病毒株中分别扩增出250bp和341bp产重庆医科大学博士学位论文摘要物，证实其中4株为A亚型，2株为B亚型。病毒经HeP一2细胞培养繁殖滴度达到7.6 x 105/Ifll一3.1 x zov/ml。 结论:通过检测感染细胞典型细胞病变、免疫荧光鉴定病毒，并经细胞培养繁殖后进行了病毒滴度测定和亚型鉴定，为下一步的研究奠定了基础。第四部分脱氧核酶培养细胞内抑制呼吸道合胞病毒复制的效应观察 背景与目的:在细胞培养系统中验证DZll33及其相应的对照寡核普酸的抗RSV活性。实验首先在A亚型RSV的代表株AZ株和B亚型RSV代表株CH18537株中进行，之后检测DZll33对从中国大陆不同地区分离得到的10株地方株RSV(包括A、B两个亚型)的抑制活性。 方法:倒置相差显微镜下观察DZ对RSV引起的细胞融合病变的抑制 作用;Ml，T定量比色法观察DZ对细胞CPE形成的影响和DZ的细胞 毒性;空斑形成实验检测DZ对病毒滴度的影响;Rl’- PCR检测DZ对 RSV mRNA表达的影响;ELISA方法检测DZ对RSV蛋白表达的影 响。 结果:DZll33在低浓度下(知M)能够抑制RSV引起的HeP一2细胞的特异性CPE，并且呈剂量依赖性，ASI