药用植物丹参SmGGPPS基因家族的研究

来源 :成都中医药大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zhangtianyu66
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中药丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参酮类化合物是丹参中主要的脂溶性活性成分,属于二萜类化合物,其合成前体物质是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)。GGPP是由牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)催化异戊烯基焦磷酸(Isoprenyl pyrophosphat,IPP)和法呢基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP)缩合形成的,为萜类化合物、赤霉素、类胡萝卜素、叶绿素等提供构建骨架,是植物体内多种初生代谢产物和次生代谢产物的共同前体,其生物合成是萜类代谢途径中的关键步骤。因此,GGPPS对萜类化合物的生物合成具有重要的调控作用。故本研究以丹参GGPPS(Sm GGPPS)基因家族为研究对象,以SmGGPPS基因家族的共表达分析、遗传变异分析及其与丹参酮类成分含量之间的相关性分析为切入点,探讨了SmGGPPS基因家族不同成员与丹参二萜途径不同代谢分支之间的关系及其调控丹参酮类成分生物合成的机制。主要研究成果如下:(1)SmGGPPS基因家族有3个成员分别与二萜途径的6个基因具有共表达关系,提示其可能参与了二萜途径不同的代谢分支通过对拟南芥GGPPS(AtGGPPS)基因家族的共表达分析,以及拟南芥与丹参的系统发育关系,预测得到与SmGGPPS基因家族具有共表达关系的候选基因,后经过实验验证发现:SmGGPPS1基因与SmCPS1、Sm KAO1、SmKAO2基因具有显著的共表达关系;SmGGPPS2基因与SmKAO2基因具有显著的共表达关系;SmGGPPS3基因与SmKSL1、SmCPS1、SmCPSent、SmKO、SmKAO1基因具有显著的共表达关系,其中SmCPS1、SmKSL1基因是丹参酮生物合成途径中的关键酶基因,SmCPSent、SmKO、SmKAO1、SmKAO2基因是赤霉素生物合成途径中的关键酶基因。由于共表达基因常具有相关的生物学功能,由此可以推测,SmGGPPS1、SmGGPPS3基因主要与丹参酮类成分以及赤霉素的生物合成密切相关;而SmGGPPS2基因主要与赤霉素的生物合成密切相关。(2)基于SRAP分子标记和基于SmGGPPS功能基因编码区、启动子区的研究揭示出丹参不同水平的遗传变异利用SRAP分子标记对不同原产地丹参样品进行分析,结果表明,基于SRAP分子标记的丹参基因组水平上的遗传变异较大。对SmGGPPS基因家族DNA序列、氨基酸序列、启动子序列以及启动子区转录因子结合位点的遗传变异分析表明,SmGGPPS1和SmGGPPS2基因的遗传变异主要存在于启动子区,且启动子序列的变异导致了部分转录因子结合位点发生变异,其编码区序列和氨基酸序列变异较小。SmGGPPS3基因的遗传变异主要存在于内含子和启动子,其中内含子1的序列变异最大,另外,SmGGPPS3基因启动子序列的变异导致部分转录因子结合位点发生变异,然而SmGGPPS3基因DNA序列的变异未导致氨基酸序列的变异,其氨基酸序列保守性较高。(3)SmGGPPS基因近端启动子区的遗传变异与丹参酮成分含量之间具有显著相关性利用紫外分光光度法测定不同遗传背景丹参样品的丹参酮类成分含量,后利用Mantel检验进行相关性分析,结果表明,SmGGPPS1基因启动子区上游-50bp、-100bp序列多态性与丹参酮类成分含量之间具有显著相关性,且越靠近转录起始位点的启动子序列与丹参酮类成分含量之间的相关性越高;SmGGPPS1基因启动子区上游-50bp、-100bp、-200bp区域内AP2、GRAS转录因子结合位点的变异与丹参酮类成分含量之间具有显著相关性;SmGGPPS3基因启动子区上游-118bp区域内WRKY转录因子结合位点的变异与丹参酮类成分含量之间具有显著相关性。而基于SRAP分子标记的丹参基因组遗传变异以及SmGGPPS基因家族3个成员的DNA序列多态性、氨基酸序列多态性与丹参酮类成分含量之间无显著相关性;SmGGPPS2、SmGGPPS3基因启动子序列多态性以及SmGGPPS2基因启动子区上游转录因子结合位点的变异与丹参酮类成分含量之间无显著相关性。综上所述,SmGGPPS基因家族不同成员参与了丹参二萜途径不同的代谢分支,提示其对丹参萜类下游途径代谢流的调控具有重要作用。同时,本研究在一定程度上揭示了丹参AP2、GRAS、WRKY转录因子通过作用于SmGGPPS基因家族不同成员的启动子参与调控丹参酮类成分的生物合成。这对深入认识丹参酮类成分的生物合成调控机理具有重要的意义,同时也为开发与丹参品质相关的分子标记以及进一步探索药用植物萜类合成途径的调控机制奠定基础。
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