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番木瓜是重要的热带水果,含有丰富的营养成分,以富含木瓜蛋白酶而著称。番木瓜产业发展过程中遇到很多问题,其中番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)病严重影响番木瓜生产。并且,这些问题依赖常规育种方法难以得到解决,必须依靠生物技术的方法。为研究番木瓜广谱抗病毒机制,培育适合我国南方地区栽培的番木瓜新品系,本研究利用RNAi介导的抗病机理,通过花粉管通道法将几个不同ihpRNA植物表达载体遗传转化番木瓜,为我国番木瓜生物技术研究提供理论及实践依据。具体研究结果如下：1、基于PRSV-HN株系CP基因序列及其保守序列,利用非对称重叠延伸PCR (Asymmetric Overlap Extension PCR),建立了快速构建植物ihpRNA结构的方法。该方法只需在一个PCR管中进行一步反应法即可获得ihpRNA结构,具有简单、快速、成本低等优点。利用本方法,成功构建了hpRNA-S1(9351-9705bp). hpRNA-S2(9406-9705bp)、 hpRNA-S3(9535-9705bp)、hpRNA-S4(9590-9705bp)、 hpRNA-S5(9655-9705bp)、 hpRNA-S6(9720-10073bp)、 hpRNA-S8(9940-10073bp)、hpRNA-S9(9974-10073bp)、hpRNA-S13(9590-10073bp)、 hpRNA-S14(9655-10073bp)10个PRSV-CP基因不同位置和不同大小靶片段的ihpRNA结构。2、利用两轮重叠延伸PCR (Overlap Extension PCR, OE-PCR)技术,建立了快速构建嵌合型植物ihpRNA结构的方法。该方法可以同时靶向多个基因或一个基因的多个位点,且构建过程简单、快速。基于PRSV-HN株系CP和VPg基因的保守序列,利用本方法,成功构建了1个嵌合型植物ihpRNA结构hpRNA-CV,该结构同时靶向PRSV上CP基因和VPg基因,有望增强RNA干扰效果,提高番木瓜对PRSV的持久抗性和广谱抗性。3、利用植物表达载体pB1121和pCambia3300,构建了hpRNA-S5、 hpRNA-S6、hpRNA-S8以及嵌合型的hpRNA-CV结构的植物表达载体,分别为pCambia-hpRNA-S5、pCambia-hpRNA-S6、pCambia-hpRNA-S8和pCambia-hpRNA-CV。4、通过花粉管通道法,将pCambia-hpRNA-S5、pCambia-hpRNA-S6、 pCambia-hpRNA-S8、pCambia-hpRNA-CV质粒DNA导入番木瓜,进行番木瓜遗传转化,转化后收获的转化番木瓜种子依次进行了除草剂(PPT)筛选、PCR检测、及RT-PCR验证试验,最终共获得了24株转基因阳性的番木瓜种子苗,其中：转pCambia-hpRNA-S5植株5株；转pCambia-hpRNA-S6植株6株；转pCambia-hpRNA-S8植株8株；转pCambia-hpRNA-CV植株5株。RT-PCR检测结果表明：筛选获得的转基因植株中目标片段获得了稳定表达。5、综合PRSV攻毒实验后供试番木瓜苗的生长发病情况和ELISA检测结果,初步认为共获得了10个抗性的转基因番木瓜株系。转pCambia-hpRNA-S5基因获得2个抗性株系；转pCambia-hpRNA-S8基因获得4个抗性株系；转pCambia-hpRNA-S6基因获得2个抗性株系；转pCambia-hpRNA-CV基因获得2个抗性株系。且初步证明转基因番木瓜抗病植株病毒积累量显著降低,病毒累积量与植株抗性性呈负相关性。6、Northern blot结果表明,当ihpRNA载体转化番木瓜后,能够较好地沉默病毒PRSV-CP基因,使转基因植株具有明显的抗PRSV病毒活性。Northern blot产生的杂交信号,随着抗病性的减弱,PRSV-CP基因RNA的积累增多,杂交信号逐渐增强。抗病植株内PRSV-CP基因RNA的积累量明显低于感病株系,即转基因植株内PRSV-CP基因RNA的积累量与植株抗病性呈负相关性。