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卵菌(Oomycetes)是一类在形态上和真菌相似,在进化上与硅藻和褐藻等藻类距离更近的微生物。其中疫霉菌属(Phytophthora)包含大量能够对农田和生态系统产生严重危害的病原物。寄主范围广泛的寄生疫霉菌(P.parasitica)可侵染1000多种植物,其侵染烟草引起的黑胫病病害是烟草生产中最严重的病害之一,能造成严重的经济损失。此外,一些对真菌有效的杀菌剂对疫霉菌无效,再加上疫霉菌的变异快,品种抗性丧失问题严重,导致其难防难治。因此,研究寄生疫霉菌与植物的互作机制,对于作物抗病育种以及卵菌病害的综合防治具有重要的意义。植物在受到损伤或者病原菌侵染时,往往诱导产生损伤相关的分子模式DAMP(Damage associated molecular pattern),包括植物分泌肽。植物分泌肽作为响应压力产生的信号分子,能够激活植物的免疫反应,例如活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生、抗病基因表达、MAPK(Mitogen-activated protein kinases)激活以及胼胝质沉积等。我们利用根癌农杆菌(Agrobacterium timefaciens)介导的基因瞬时表达技术,筛选激发植物免疫反应的基因,鉴定到一个烟草编码的分泌肽Nt PROPPI(Phytophthora parasitica Induced),可激活烟草的免疫反应,增强烟草对寄生疫霉菌的抗性,确认了PPI是DAMP分子。主要研究结果如下:1、通过根癌农杆菌介导的基因瞬时表达技术,鉴定得到普通烟草Nt PROPPI,其编码一个含有SGPS-Gx GH结构域的分泌肽;Nt PROPPI在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中有两个同源性较高的同源蛋白Nb PROPPI1和Nb PROPPI2,序列相似度分别为95.6%和91.2%。Nt PROPPI蛋白全长89个氨基酸,其N端24个氨基酸残基组成分泌信号肽,C端含有一个SGPS(Ser-Gly-Pro-Ser)-Gx GH(Gly-x-Gly-His)结构域,该结构域在拟南芥、番茄和马铃薯中比较保守。在普通烟、本氏烟、番茄和马铃薯叶片上瞬时表达Nt PROPPI的结果表明,Nt PROPPI特异诱导普通烟草叶片黄化,但不能诱导其他物种的叶片黄化。Nt PROPPI在本氏烟草中有5个同源蛋白,其中Nb PROPPI1(Niben101Scf00803g01016.1)和Nb PROPPI2(Niben101Scf03747g00005.1)与Nt PROPPI的相似性最高。2、Nb PROPPI1和Nb PROPPI2能激发烟草免疫反应,增强烟草对寄生疫霉菌的抗性,二者的表达受寄生疫霉菌和水杨酸(SA)诱导在普通烟中瞬时表达Nt PROPPI及Nb PROPPI1/2能诱导叶片产生免疫反应。对Nb PROPPI1/2在胁迫条件下的表达模式研究发现,Nb PROPPI1/2在寄生疫霉菌侵染烟草6 h即被显著上调表达,同时Nb PROPPI1/2受水杨酸甲酯Me SA诱导上调表达,不受ET前体ACC、茉莉酸甲酯Me JA及损伤处理诱导。通过病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术将Nb PROPPI1/2共沉默后,沉默植株对寄生疫霉菌的抗病能力减弱。瞬时过表达以及接菌试验结果表明,过表达Nb PROPPI1和Nb PROPPI2均能增强本氏烟草对寄生疫霉菌的抗性。此外,为了证明Nb PROPPI1/2能被分泌到细胞外,我们在本氏烟叶片中瞬时表达C端融合GFP的Nb PROPPI1和Nb PROPPI2蛋白,进行亚细胞定位观察。质壁分离后在质外体中均能发现明显的Nb PROPPI1-GFP和Nb PROPPI2-GFP荧光信号,表明Nb PROPPI1/2定位在质外体。3、Nb PPI是烟草DAMP分子,其免疫功能依赖于BAK1,C端8个保守氨基酸是Nb PPI1激活免疫功能的关键区域。我们化学合成了Nb PROPPI1和Nb PROPPI2蛋白的C端保守结构域的肽段,并分别命名为了Nb PPI1和Nb PPI2。接菌和生化实验证明它们是DAMPs分子:1)在本氏烟草的叶片上注射Nb PPI1和Nb PPI2,能增强烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性;2)用Nb PPI1和Nb PPI2处理本氏烟草叶片可诱导PTI相关标记基因WRKY33和FRK的表达,激活MAPK磷酸化;3)Nb PPI1促进flg22引起的胼胝质累积和活性氧迸发;4)Nb PPI1抑制烟草幼苗的主根生长。BAK1在DAMP激活植物免疫中常作为共受体发挥作用。我们利用VIGS技术获得TRV2-BAK1植株并对Nb PPI1的DAMP活性进行研究发现,在TRV2-BAK1沉默植株中,Nb PPI1诱导的烟草对寄生疫霉菌抗性减弱,并且Nb PPI1对WRKY33的诱导表达以及对flg22引起的ROS促进作用均受到显著抑制。说明Nb PPI1的DAMP活性需要BAK1。通过与其他物种的同源蛋白进行序列比对分析,我们发现与拟南芥同源蛋白不同,茄科PROPPI蛋白在SGPS结构域下游含有8个氨基酸,这8个氨基酸在茄科PROPPI蛋白中比较保守。为研究这个8个氨基酸对Nb PROPPI DAMP免疫活性的影响,我们合成了缺失8个氨基酸的肽段Nb PPI1-△C8。烟草瞬时表达实验表明,单独注射合成小肽Nb PPI1可以抑制寄生疫霉菌的侵染,但是注射Nb PPI1-△C8后,其抗病功能消失,也无法促进flg22引起的活性氧迸发,同时Nb PPI1对烟草幼苗主根生长的抑制作用也受到影响,所以Nb PPI1的C端8个保守氨基酸是其激活免疫功能的关键区域。