杀鱼爱德华氏菌EIB202感染鱼类并引发爱德华氏菌病,该病给世界水产养殖业造成巨大经济损失。本实验室针对EIB202开发了减毒活疫苗WED,该疫苗注射接种大菱鲆的免疫效果良好,但浸泡接种免疫保护效果却不尽人意。为改善疫苗浸泡接种的免疫效果,本工作对EIB202、WED以及TTSS、aroC、pEIB202单缺失及双缺失突变株的毒力相关特性进行了研究,以期寻找和病原菌定植及粘附相关的功能基因,为未来疫苗浸泡接种免疫效果的改善奠定基础。实验结果发现耐药性毒力大质粒pEIB202对该病原脂多糖LPS的合成及在宿主黏膜组织中的定植有一定影响,暗示了大质粒在该病原的定植中具有重要作用。进一步分析该质粒序列,发现其携带53个潜在阅读开放框架(Open reading frame,ORF),且在杀鱼爱德华氏菌中不以单拷贝形式存在,难以进行质粒上与病原菌定植及粘附相关ORF的筛选与鉴定,故进行了质粒复制子区域的定位。通过Hind III和Pst I酶切pEIB202亚定位质粒复制子区域,得到质粒pMHJE10和pMPJE8,经鉴定其均携带质粒pEIB202中41 970-22 927 bp区域的24 661 bp DNA片段;进一步Hind III/Pst I及Hind III/Nhe I联合酶切pMHJE10亚定位质粒复制子区域,得到质粒pAPH8和pANH16,经鉴定其均携带质粒pEIB202中6 408-22 927 bp区域的16 520 bp DNA片段。同时通过Sau3AI部分酶切消化pEIB202进行质粒复制子区域的精细定位,得到众多抗性转化子,经PCR鉴定和测序分析等发现,均携带pEIB202中18 249-21 335 bp区域的3087 bp DNA片段;在此基础上利用PCR逐步缩短得到的最小质粒pRep-q77,包括的DNA片段为pEIB202中18 837-20 816 bp区域的1980 bp,即pEIB202质粒复制子定位于此区域,内部携带ETAE_RS16765(转录抑制因子)和ETAE_RS16770(复制蛋白)。对复制蛋白序列的同源分析发现,其与鲑鱼立克次氏体的复制蛋白高度同源,且具有引物酶和DNA结合结构域,可能具有独立解旋能力;而转录抑制因子与点状念珠藻中质粒维持系统的抗毒蛋白具有一定的同源性,与质粒的复制与维持密切相关。质粒拷贝数测定表明亚克隆质粒在杀鱼爱德华氏菌和大肠杆菌中存在拷贝数均不高,且在杀鱼爱德华氏菌中大部分亚克隆的拷贝数高于大肠杆菌中,但最小质粒pRep-q77的拷贝数却后者高于前者。对pRep-q77稳定性分析发现,两次无压力传代后有49%杀鱼爱德华氏菌和25%大肠杆菌仍携带该质粒。对携带较大亚克隆pMHJE10和pMPJE8的杀鱼爱德华氏菌其毒力和黏附能力的研究表明,注射接种pMHJE10/△pEIB202和pMPJE8/△pEIB202后,斑马鱼存活情况与注射野生株EIB202或者△pEIB202的相似,即毒力没有明显变化;但浸泡接种后两病原在宿主黏膜组织的定植量却大幅下降,比△pEIB202低100倍,远低于野生株EIB202,说明质粒上确实存在对黏膜定植有重要作用的功能基因。对pEIB202复制子的定位为后续研究其携带基因的功能奠定了一定基础,而对质粒pMHJE10和pMPJE8在病原菌毒力与黏膜定植方面的初步探索也为未来改善疫苗浸泡免疫效果提供思路。