Her2/neu基因沉默对脑膜瘤细胞增殖的影响

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目的:1.搜集人脑膜瘤术后标本进行原代培养并鉴定。2. Her2siRNA慢病毒转染人脑膜瘤细胞,观察转染前后细胞的增殖活性和生物学行为的改变。方法:1.在神经外科术后搜集新鲜的脑膜瘤组织,经过原代和传代培养后获得的脑膜瘤细胞,在对数生长期用免疫组化法和FISH法对其进行鉴定。2.将Her2siRNA慢病毒载体转染到人脑膜瘤细胞中,倒置显微镜在1-4天4个时间点观察病毒的表达,确定最佳感染复数(MOI)。3.实验分为三组:①Control组:用含10-15%血清的DMEM培养基培养人的脑膜瘤细胞;②M ock组:感染空载体的脑膜瘤细胞;③Her2siRNA组:感染了Her2siRNA慢病毒的脑膜瘤细胞。4.慢病毒感染72小时后,用CCK-8法检测各组脑膜瘤细胞的增殖抑制率;同时应用RT-PCR法检测Her2/neu基因的表达情况;Western blot法检测Her2、VEGF和Ki-67蛋白的表达情况。5.将各组细胞接种至裸鼠腋下检测成瘤情况。结果:1.搜集新鲜的人脑膜瘤术后标本,进行原代培养,在10%DMEM培养基培养下,贴壁后呈多角形生长。2.由上海汉恒股份有限公司建立Her2siRNA慢病毒载体,包装产生的病毒滴度为1×108TU/ml。3. Her2siRNA慢病毒感染人脑膜瘤细胞,当MOI值为40时,48小时后镜下可见少量荧光表达,72小时后荧光表达量和强度增加。4. CCK-8法检测各组脑膜瘤细胞的增殖情况:与Control组相比,Her2siRNA组抑制率最高(P<0.01);而病毒转染后48小时开始对脑膜瘤细胞有抑制作用,72h抑制作用最强;而Control组与Mock组相比并无差别(P>0.05)。5. RT-PCR检测Her2mRNA的表达情况:与Control组、Mock组相比,Her2siRNA组的mRNA的表达程度显着下调(P<0.01)。6. Western blot检测Her2、VEGF、Ki-67蛋白的表达变化:与Control组与Mock组相比,Her2siRNA组的蛋白表达程度显著下调(P<0.01);而Control组与Mock组相比无明显差别(P>0.05)。7.裸鼠移植瘤变化:与Control组和Mock组相比,Her2siRNA组的细胞接种于裸鼠腋下的移植瘤发展速度明显减慢(P<0.01),Control组与Mock组相比没有显著差异(P>0.05)。结论:1.使用混合酶逐步消化法高效培养了人脑膜瘤细胞,并成功转染。2.离体实验表明,Her2/neu基因沉默后脑膜瘤细胞增殖能力下降,同时降低Her2mRNA的表达,减少Her2、VEGF、Ki-67蛋白的表达。3.动物实验表明,Her2/neu基因沉默后裸鼠移植瘤增殖能力下降。
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