大鼠ESC复合猪小肠粘膜下层体外构建组织工程皮肤的实验研究前言临床上，应用良好的方法处理各种原因所致的皮肤创面，使之获得快速、有效、持久、良好的修复，仍是目前器官移植领域亟待解决的基本问题之一。组织工程的出现和发展为新型人工皮肤的构建提供了一条崭新的途径。表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC)是目前比较公认的适于构建组织工程皮肤的种子细胞，而且在特定的条件和适宜的微环境状态下，表皮干细胞具有多向分化潜能，可形成汗腺、毛发和毛囊等皮肤附属器官，这对于体外构建组织工程皮肤非常重要，但是迄今为止，相关的ESC生物学特性的体外连续观察，国内外很少报道。近几年有文献报道，猪小肠粘膜下层(small intestinal submucosa，SIS)可以作为组织工程器官的支架，经过物理和化学的方法处理后，它与皮肤组织结构很类似，还有报道，SIS中含有各种利于细胞生长的因子，例如转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)等等，这些生长因子在组织的修复和重建中有着重要的促进作用，这是其它细胞外基质材料所不能比拟的。本实验通过体外观察表皮干细胞的生长、扩增和分化，探讨表皮干细胞的分化发生机制，利用组织工程的方法，体外观察猪小肠粘膜下层促进大鼠全层皮肤缺损的愈合，进一步探讨表皮干细胞在皮肤愈合中的变化，为体外构建组织工程皮肤提供实验依据。材料与方法一、实验动物和材料：(一)实验动物：Wistar大鼠，雌雄不限(由中国医科大学实验动物部提供)、新鲜猪小肠的空肠段(由沈阳市肉联加工厂提供)(二)实验材料：DMEM培养液(GIBCO／BRL)，胎牛血清(TDB生物制品公司)，Integrinβ1、p63及keratin15抗体(neuomaker生物公司)，FITC／CY3免疫荧光二抗(武汉博士得生物制品公司)，PBS液，0.25％胰蛋白酶．二、实验方法：(一)Wistar大鼠表皮干细胞(ESC)的体外分离、培养及鉴定利用胰酶冷热交替消化组织块法对Wistar大鼠表皮干细胞进行培养，然后利用相差显微镜对培养细胞进行体外连续观察，测定克隆细胞形成率(CFE)，通过多聚赖氨酸分离表皮干细胞，进行光镜、integrinβ1、Keratin 15以及P63细胞免疫荧光、免疫组化染色及扫描电镜进行观察。(二)猪小肠粘膜下层(SIS)的生物学特性的观察利用物理和化学方法制备猪小肠粘膜下层，通过光镜、电镜以及图象分析对其进行观察及测量，皮下埋植观察生物相容性。(三)猪小肠粘膜下层(SIS)修复全层皮肤缺损过程中皮肤创面边缘表皮干细胞的定位及再分布观察随机挑选40只Wistar大鼠，分别在每个大鼠背部的脊柱两侧切取面积均为2.54cm~2的圆形全层皮肤缺损创面，将创面随机分为2组，即SIS治疗组(40个创面)，空白对照组(40个创面)。分别于伤后3天、1周、2周和3周通过组织学方法检查，动态观察各组治疗效果，并以integrinβ1、keratin15以及p63免疫组化SP法和FITC／CY3荧光免疫标记检测皮肤创面愈合过程中表皮干细胞在创面边缘的分布情况。实验结果一、表皮干细胞(ESC)的生长特性及组织学观察皮肤组织块消化后浸泡于培养瓶内，24小时后，开始有细胞出现，形状大小不一；此后，细胞不断从皮肤组织块中爬行出来。接种3周，可见明显的集落形成。集落中的细胞不断扩增，传代细胞与原代细胞相似，4～5天即可长满培养瓶。体外连续观察2周，发现毛发样结构出现在细胞的周围，数量较多。细胞明显克隆样生长，克隆形成率高，与BMSCS组比较，P＜0.05，具有统计学意义。ESC的integrinβ1、Keratin 15以及P63的检测结果阳性率较高，细胞SP免疫组化和FITC／CY3荧光标记的结果是一致的．二、猪小肠粘膜下层(SIS)的生物学特性的观察光镜显示，SIS的网架结构形态学特点是由浅入深，密度逐渐加大，孔径率逐渐增加，孔径直径逐渐变小，图像分析结果，孔径率在70％-90％之间，平均孔径大小为250μm左右。扫描电镜显示胶原纤维结构规整，网孔丰富，纤维连续。皮下埋植实验显示材料具有良好的组织相容性，无明显炎症反应，血管化早，后期经改建可形成纤维排列较规则的类真皮样结构。三、猪小肠粘膜下层(SIS)修复全层皮肤缺损过程中创缘表皮干细胞的定位及再分布的观察两组创面愈合率在SIS组明显高于空白组。于创缘表皮的棘层或颗粒层出现了散在的integrinβ1、K15以及p63免疫荧光和免疫组化染色阳性细胞，且越接近创面这些阳性细胞越密集，其数量随着创面的缩小渐渐增加，直到创面愈合。实验结论本研究发现：1．利用胰酶冷热交替消化组织块法获得的表皮干细胞(ESC)数量多，而且较容易发生分化，可初步实现毛发体外的分离培养，使体外构建组织工程皮肤变为可行。2．经过本实验方法制备的SIS，韧性大，结构、层次分明，生物相容性良好，血管化能力强，是一种理想的细胞外支架，是组织工程进行组织修复的良好材料。3．猪小肠粘膜下层(SIS)可以促进表皮干细胞能动的参与创面的修复，创缘表皮干细胞再分布的主要机理可能是促进创面再上皮化以及皮肤附属器的形成。