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研究背景与目的巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成成份,在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移过程中发挥着重要作用,位于肿瘤微环境中的巨噬细胞通常被称为“肿瘤相关巨噬细胞”(Tumor-associated macrophages,TAMs)。近年来越来越多的研究表明,在不同的治疗方法或肿瘤类型中,TAMs可起到增强或拮抗治疗方法的效应,也可在治疗后驱动机体修复起到一定作用。经典活化途径的巨噬细胞(classically activated macrophage)亦称为M1型巨噬细胞,由Th1细胞因子(如干扰素γ)、外源性TNF-α或者内源性TNF-α的诱导剂(如细菌代谢产物脂多糖等)诱导激活,并分泌多种炎症因子(如IL-6、IL-12、IL-1、TNF-α)、趋化因子(如CCL2、CCL3)以及趋化因子配体(如CXCL9、CXCL10)等。M1型巨噬细胞能够杀伤肿瘤细胞、清除感染病原体,同时可作为一种有效的炎症介质,参与炎症反应。雷公藤红素(Celastrol,Cel)是一种天然化合物,具有抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等多种药理活性。Cel通过抑制AKT/m TOR/P70S6K通路的活化,抑制血管生成和肿瘤的生长;也可通过调控生存信号通路,如Notch或NF-κB的活性抑制肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡;也有研究表明Cel是天然蛋白酶体抑制剂,通过抑制20S蛋白酶体的活性诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤的生长。本研究利用细菌代谢产物脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导巨噬细胞,即M1型巨噬细胞,得到培养上清液,使用上清液(M1 macrophage products/LPS-stimulated macrophage products,LSMP)与Cel单独或者共同作用于乳腺癌细胞系MDA-MB-231和前列腺癌细胞系PC-3,并采用MTT、q RT-PCR以及Western blotting等实验方法检测LSMP对Cel导致肿瘤细胞凋亡作用的影响及其潜在的作用机制。结果表明,LSMP具有增强Cel致MDA-MB-231细胞和PC-3细胞凋亡的作用,此作用可能与caspase-3,8,9的激活以及NF-κB通路活化的抑制,进而下调凋亡抑制蛋白XIAP和c IAP1/2的表达有关。这些结果说明,受不同刺激因素作用的巨噬细胞能够调控肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。巨噬细胞可能成为临床抗肿瘤药物效应差异研究的新靶点。研究方法:1.不同浓度(10%、30%、50%、100%)的LSMP与Cel(1μM、1.5μM)单独或者共同作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3,设立空白对照组,采用MTT实验、克隆形成实验和划痕实验对肿瘤细胞的增殖和迁移能力进行检测。2.不同浓度(0%、50%、100%)的LSMP与Cel(1.5μM)单独或者共同作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3,设立空白对照组,采用流式细胞技术对肿瘤细胞的凋亡情况进行检测。3.不同浓度(30%、50%、100%)的LSMP与Cel(1.5μM)单独或者共同作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3,设立空白对照组,采用Western blotting对不同时间点PARP、pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9的蛋白表达水平进行检测。4.不同浓度(30%、50%、100%)的LSMP与Cel(1.5μM)单独或者共同作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3,设立空白对照组,采用Western blotting方法检测不同时间点泛素化蛋白(Ub-prs)、IκB和TNF-α的蛋白表达水平以及胞浆和胞核核转录因子κB P65(NF-κB-P65)的水平。5.不同浓度(30%、50%、100%)的LSMP与Cel(1.5μM)单独或者共同作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3,设立空白对照组,采用Western blotting对不同时间点的凋亡抑制蛋白XIAP和c IAP1/2的蛋白表达水平进行检测。6.利用si RNA干扰NF-κB-P65基因的表达,采用q RT-PCR和Western blotting方法,检测在LSMP(50%)与Cel(1.5μM)共同作用下NF-κB-P65、XIAP、c IAP1/2的基因和蛋白表达情况。结果:1.与Cel单独作用相比,LSMP与Cel共同作用,可明显增加两种肿瘤细胞的凋亡率,抑制细胞的增殖和迁移。2.与Cel单独作用相比,LSMP与Cel共同作用,可明显促进PARP、pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9的降解。3.与Cel单独作用相比,LSMP与Cel共同作用下,蛋白酶体活性无显著变化。4.与Cel单独作用相比,LSMP与Cel共同作用,可明显抑制XIAP、c IAP1/2表达。5.与Cel单独作用相比,LSMP与Cel共同作用下,可明显抑制IκB的降解、核转录因子NF-κB-P65的核转位及NF-κB信号通路的活化,同时降低TNF-α的蛋白表达量。6.与LSMP+Vector si RNA作用组相比,LSMP与Cel共同作用,可明显抑制NF-κB-P65、XIAP、c IAP1/2 m RNA水平和蛋白水平的表达结论研究结果表明:LSMP可增强Cel对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3增殖、存活和迁移能力的抑制作用。LSMP在不改变Cel对蛋白酶体活性抑制作用的情况下,增强了其促进肿瘤细胞凋亡的能力,是通过阻断IκB的磷酸化,使其降解减少,抑制了NF-κB-P65的核转位,进而抑制NF-κB信号通路的活化,下调其下游的凋亡抑制蛋白XIAP、c IAP1/2的表达,同时促进了PARP、pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9的降解,激活凋亡相关通路,最终诱导肿瘤细胞凋亡。