实验背景:糖尿病已成为威胁全球人类健康的“沉默杀手”,其慢性并发症成为糖尿病治疗的又一敌人。糖尿病可导致心血管病死亡率增加2-4倍,并可导致多脏器的结构和功能障碍,它具有发病率高、致残率高和致死率高等特点。许多研究表明,血脂异常是糖尿病及其并发症发展的主要因素,而67.1%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者伴有血脂异常。因此,深入探索潜在的损伤机制和有效的干预靶点对早期预防和治疗糖尿病伴有高脂血症的心血管并发症和糖尿病患者的预后十分必要。T2DM心血管并发症是引发糖尿病患者死亡的主要原因,既往对其研究主要着眼于冠脉血管和心肌细胞。近年来,越来越多的研究表明,糖尿病心脏微血管损伤在糖尿病心血管并发症的进程中发挥非常重要的作用。心脏微血管居于循环末稍,直接接触心肌细胞,决定了心肌的血液灌注程度。在糖尿病状态下,心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)是最早且最易受到各种损伤的,并且其损伤比大血管及心肌细胞早得多。临床上常见的微血管性心绞痛、糖尿病性心肌病和心脏冠状动脉介入术后无复流现象等均与心脏微血管损伤密切相关。目前研究发现临床中常见的X综合征、冠状动脉造影阴性的心绞痛等患者可能均与心脏微血管损伤紧密相关。即使没有明显的冠状动脉血管狭窄,糖尿病心脏微循环障碍也可能导致临床不良事件的发生。因此,改善糖尿病心脏微血管损伤对于糖尿病心血管并发症的防治非常重要,然而,当前仍然没有高效的干预措施来减缓糖尿病心脏微血管损伤的进程。线粒体功能障碍与糖尿病心血管并发症密切相关。真核生物线粒体内含有上千种蛋白质,其中仅1%由线粒体自身合成,其余大部分由线粒体外核糖体合成,再经线粒体外膜和/或内膜转运到线粒体中以发挥相应的生理功能。线粒体外膜转位酶70(translocase of the outer mitochondrial membrane 70,Tom70)就是属于线粒体外膜转运蛋白中的一种。Tom70在心血管疾病如心力衰竭、心脏肥厚、心肌缺血/再灌注损伤中发挥其转运蛋白的功能。我们课题组既往研究发现,Tom70通过减少线粒体ROS的生成减轻心梗后心肌重塑。但到目前为止,Tom70在糖尿病心脏病和糖尿病心脏微血管损伤中的具体作用及其机制尚未见报道,值得进一步深入研究。我们之前的初步实验发现,Tom70在心脏微血管内皮中表达,并在糖尿病的病理条件下发生变化,这表明它可能参与了糖尿病心脏微血管损伤的发展过程。二甲双胍是一种经典的双胍类口服降糖药,是具有降低心血管风险的少数降糖药之一。以前关于其内皮保护作用的研究主要着眼于大血管内皮,尚不清楚二甲双胍是否对糖尿病心脏微血管内皮有保护作用。有研究指出,氧化应激是糖尿病和心血管疾病的常见机制,氧化应激可引起内皮细胞功能失调,从而诱发心血管并发症。既往研究发现,二甲双胍可改善心肌线粒体功能,而Tom70作为一种重要的线粒体功能蛋白,二甲双胍是否通过Tom70调控线粒体功能尚不清楚。二甲双胍的内皮保护作用是否依赖于Tom70及抗氧化应激作用仍需要进一步探索。为验证上述猜想,本研究分为4部分:1、构建伴有高脂血症T2DM的动物和细胞模型,观察高糖高脂对心脏微血管内皮的损伤;2、明确二甲双胍对高糖高脂心脏微血管内皮损伤的保护作用;3、探索Tom70在高糖高脂心脏微血管内皮损伤中的作用;4、阐明Tom70是二甲双胍发挥心脏微血管内皮保护作用的重要分子。研究目的:1.明确二甲双胍对T2DM心脏的保护作用,该保护作用可能与它的心脏微血管内皮保护作用密切相关。2.明确二甲双胍对高糖高脂心脏微血管内皮细胞损伤的保护作用。3.筛选线粒体功能蛋白Tom70,明确其在高糖高脂CMECs损伤中的作用。4.明确Tom70是否介导了二甲双胍的心脏微血管内皮保护作用。研究方法:本研究分动物和细胞实验两部分。动物实验以构建的伴有高脂血症的T2DM小鼠模型为基础,细胞实验以提取培养的WT小鼠原代CMECs为基础。1.将6周龄雄性野生型小鼠随机分为Control组及T2DM组。Control组给予正常饲料喂养和腹腔注射柠檬酸盐缓冲液;T2DM组给予高脂饮食和腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ,30 mg/kg.d×5d)。其中,造模成功的T2DM分为对照组、胰岛素治疗组及二甲双胍治疗组。2.利用腹腔葡萄糖耐量试验及胰岛素耐量试验评估糖耐量及胰岛素敏感性,检测小鼠体重、空腹/随机血糖、血脂等生化指标。3.利用小动物超声检测每组小鼠的心功能、小动物PET/CT测定心脏的葡萄糖摄取能力、Masson染色测定心肌纤维化水平。4.以聚合物树脂灌注每组小鼠的心脏,并在扫描电镜下观察心脏微血管内皮连接的完整性。5.分离培养小鼠原代CMECs,将其分为正常组、高糖组、高糖高脂组,干预不同浓度的二甲双胍。最后,利用慢病毒转染和Tom70-siRNA技术分别去上调和下调Tom70的表达。6.采用免疫荧光法鉴定CMECs。7.CCK-8法检测CMECs的细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,NO荧光探针和ELISA试剂盒检测NO的生成。8.采用超氧化物ELISA试剂盒及超氧化物阴离子荧光探针检测ROS生成,谷胱甘肽检测试剂盒检测CMECs谷胱甘肽含量。9.利用透射电子显微镜观察CMECs线粒体形态结构变化,线粒体ATP试剂盒测定线粒体ATP含量。10.用qRT-PCR、Western Blot和细胞免疫荧光法检测Tom70的mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.T2DM小鼠的体重、空腹/随机血糖和血脂等显著升高;而长期二甲双胍可改善T2DM的体重、血糖和血脂等。2.T2DM可导致小鼠心脏舒张功能不全、心脏葡萄糖摄取能力下降及心肌纤维化;而二甲双胍可显著改善T2DM心脏舒张功能、心脏葡萄糖摄取能力及心肌纤维化水平。3.T2DM可损伤心脏微血管内皮的完整性;而二甲双胍可改善T2DM心脏微血管损伤。4.高糖高脂可导致CMECs活力下降、凋亡增加及NO合成减少;而二甲双胍可改善CMECs的活力、凋亡及NO合成功能。5.高糖高脂可增加CMECs的氧化应激水平;而二甲双胍可减轻氧化应激水平。6.高糖高脂可影响CMECs线粒体的形态和功能;而二甲双胍可改善线粒体功能障碍。7.糖尿病影响线粒体外膜转运系统的分子表达,高糖高脂干预可显著抑制Tom70的表达。8.用慢病毒感染CMECs过表达Tom70,发现上调Tom70可改善高糖高脂条件下的线粒体损伤、氧化应激水平、CMECs凋亡和NO合成功能。9.二甲双胍促进高糖高脂条件下Tom70的mRNA及蛋白表达。10.利用特异性siRNA敲低CMECs中Tom70表达,发现下调Tom70可阻断二甲双胍的线粒体保护和抗氧化应激作用,最终阻断了二甲双胍的CMECs保护作用。研究结论:1.T2DM影响心脏的舒张功能、葡萄糖摄取以及心肌纤维化水平,这与T2DM心脏微血管内皮损伤有关;长期二甲双胍治疗可改善T2DM心脏的舒张功能、葡萄糖摄取和心肌纤维化水平,这与其对心脏微血管内皮的保护密切相关。2.Tom70在高糖高脂CMECs损伤中具有重要的保护作用,二甲双胍可通过激活Tom70来减轻线粒体功能障碍和氧化应激水平进而改善CMECs损伤,这可能是其发挥糖尿病心脏保护作用的重要机制之一。