论文部分内容阅读
SIRT1是一种依赖于NAD~+的组蛋白去乙酰化酶,是哺乳动物中研究最多的Sirtuins家族成员。其参与调节哺乳动物体内的许多生理过程,特别在脂代谢、糖代谢、细胞凋亡和胰岛素分泌中发挥着重要作用。肝脏是参与脂质代谢的重要器官,与家禽脂类代谢、鸡蛋营养和产蛋性能息息相关。SIRT1在哺乳动物中能促进脂肪酸氧化分解,减少脂肪堆积。作为一个哺乳动物中的明星基因,其在家禽脂肪代谢过程中又会扮演着什么角色?脂肪因子Visfatin处理鸡肝脏原代细胞,可以引起SIRT1表达的上调。为了进一步研究该基因在脂肪代谢过程中的生物学效应,利用荧光定量技术分析SIRT1基因在鸡不同组织和前体脂肪细胞不同分化时期中的表达规律;同时在固始鸡-安卡鸡F2代资源群对该基因进行了SNP多态性与经济性状的关联分析;在鸡的皮脂、腹脂、胸肌和腿肌组织中探索不同基因型对SIRT1基因表达的影响;最后通过双荧光素酶报告试验分析不同单倍型对SIRT1转录活性的影响,得到如下试验结果:1. Visfatin处理鸡胚肝脏原代细胞,SIRT1显著上调(P<0.05),在鸡前体脂肪细胞中,SIRT1、ap2和PPARγ表达量在0-4d表达较低且无显著变化,培养到6 d时SIRT1、ap2和PPARγ表达量显著升高(P<0.05),6d和8d无显著变化。SIRT1在75周鸡各组织呈现广泛性表达,其中在心脏、肝脏和肺脏组织中高表达,与其它组织差异显著(P<0.05),其次是胸肌、腿肌、肾、下丘脑,表达量最低的是皮脂和腹脂。这些结果提示SIRT1在肝脏中受脂肪因子Visfatin的调控,参与前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞的过程。2. 通过DNA混池测序方法,鉴定到2个位于SIRT1基因5’UTR区域的突变,分别是有2bp CG插入g.-1552＿-1553ins和2bp GC缺失g.-450＿-451del。与固始鸡-安卡鸡F2资源群进行关联分析,g.-1552＿-1553ins位点与胸肌肌纤维长径性状关联显著,DD型个体显著大于II型(P<0.05);g.-450＿-451del与腿肌肌纤维长径、腿肌肌纤维短径、腿肌肌纤维周长和腿肌肌纤维面积比显著相关,且II型个体显著大于ID型(P<0.05),提示SIRT1参与肌纤维的生长过程。此外,g.-1552＿-1553ins位点与总胆固醇和低密度脂蛋白显著相关(P<0.05),g.-450＿-451del与皮脂重、皮下脂肪厚度和碱性磷酸酶显著相关(P<0.05),两个Indel位点都是DD基因型性状的含量显著高于II型和ID型(P<0.05)。提示SIRT1基因两个Indel位点DD基因型在脂肪相关性状中都是显著高于其它两种基因型,推测SIRT1参与血液中脂肪的运输以及皮脂的代谢过程。3. 在g.-1552＿-1553ins位点,SIRT1基因在胸肌组织的表达量II型和ID型个体显著高于DD型(P<0.05);腿肌组织中ID型和DD型显著高于II型(P<0.05);皮脂和腹脂中DD型表达量显著低于II型和ID型(P<0.05)。在g.-450＿-451del位点,SIRT1基因表达量在胸肌组织中,ID型表达高于II型和DD型(P<0.05);腿肌组织中,II型个体显著低于ID型和DD型(P<0.05);皮脂组织中,II型和ID型显著高于DD型(P<0.05);在腹脂组织中,ID型的SIRT1表达量高于II型和DD型(P<0.05)。这些结果表明Indels的不同基因型可以影响SIRT1的表达,脂肪组织中DD型SIRT1表达量是最低的,推测SIRT1能够减少皮脂的重量和厚度,减少血液中胆固醇和低密度脂蛋白的含量。4. 构建SIRT1的Indels位点不同单倍型的双荧光素酶报告载体,转染293T细胞系中,发现IIII单倍型的SIRT1基因的活性最高,是其它单倍型活性的1.5倍(P<0.05);DDDD型、DDII型和IIDD型的单倍型相比,SIRT1转录活性差异不显著(P>0.05)。生物信息学分析发现SIRT1基因5’UTR区域Indels突变,影响转录因子结合位点的改变,导致SIRT1的转录活性的改变,双荧光报告载体结果也验证了不同Indels基因型会影响SIRT1的表达。由以上结果,提示SIRT1参与鸡前脂肪细胞分化过程,减少皮脂的重量和厚度,减少血液中胆固醇和低密度脂蛋白的含量,且其5’UTR的两个Indels通过影响转录因子结合位点,导致SIRT1的活性改变,其在鸡上参与脂肪代谢中所扮演的角色值得更深一步的探索。