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目的:构建ECEL1基因的慢病毒载体。方法:1.依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(sh RNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和Eco RI双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用“HIV-1 p24抗原ELISA法”测定样品滴度。2.ECEL1基因RNA干扰慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察显示感染率。并使用real-time PCR法检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后m RNA的表达量。结果:1.照ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。以及通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测样品病毒滴度为3E+8TU/m L。表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。2.ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,于72小时后镜下荧光观察,观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定。使用real-time PCR的方法,实验组人肝癌细胞(BEL-7404)细胞中ECEL1基因在m RNA水平的表达量受到抑制(p<0.05),敲减效率达到70.5%。结论:成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品。并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404),为下一步探讨ECEL1基因对肝癌细胞的功能影响奠定了基础。